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Abstrakt

Eine Methode zur In-situ -Lokalisierung von einzelsträngigen und doppelsträngigen RNA-Elementen in der 3'-untranslatierten Region des Hepatitis C-Virusgenoms

Elodie Rance, Jing Hu, Jerome E. Tanner und Caroline Alfieri

Die Fähigkeit, Sekundär- und Tertiärstrukturen, wie sie in ihrem nativen Zustand im Genom von RNA-Viren vorhanden sind, aufzulösen, ist ein wesentlicher erster Schritt zur Aufklärung des Replikationsprozesses dieser Viren. Das Genom des Hepatitis-C-Virus (HCV) besteht aus einer einzelsträngigen (+) RNA, deren Replikation hauptsächlich durch die 3'-untranslatierte Region (3'UTR) gesteuert wird. Die 3'UTR besteht aus einer genotypspezifischen variablen Region (VR), einer Poly-(U/UC)-Wiederholung und einer konservierten 98-Basen- Sequenz , die als X-Schwanz bezeichnet wird. Obwohl Strukturmodelle der 3'UTR aus biochemischen Analysen in vitro vorgeschlagen wurden, ist ihre native Struktur als Teil des vollständigen viralen Genoms, das in der intrazellulären Umgebung existiert, ungewiss. Um die nativen doppelsträngigen (ds) und einzelsträngigen (ss) RNA-Strukturen, die in der 3'UTR des vollständigen Genoms enthalten sind, abzubilden, führten wir eine chemische Markierung in situ in Kombination mit einer zielgerichteten RT-qPCR durch. Die Ergebnisse zeigen, dass ssRNA in den VR-Poly (U/UC)-Wiederholungssequenzen vorherrscht, während dsRNA-Elemente auf den X-Schwanz beschränkt sind. Durch chemische Markierung in situ wurde auch ein einzigartiges dsRNA-Element identifiziert, das sich in der VR-Poly (U/UC)-Wiederholungsregion befindet, die teilweise aus Sequenzen besteht, die außerhalb der 3'UTR liegen. Die hier beschriebenen Ergebnisse stellen einen ersten Bericht über die In-situ-Untersuchung und Erkennung von Sekundärstrukturen dar, die innerhalb der 3'UTR-Sequenz des HCV-Genoms vorhanden sind. Die Verwendung intrazellulärer RNA-modifizierender Mittel zur Abgrenzung von dsRNA und ssRNA in Kombination mit PCR zur Amplifikation von Spurenmengen der Ziel-RNA hat eine potenzielle Anwendung bei der Kartierung nativer Sekundärstrukturen innerhalb komplexer intrazellulärer RNAs.