Fortschritte in der Gentechnik
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Abstrakt

Ein neuer Ansatz zur Einführung spezifischer Punktmutationen im Gen, das für Dystrophin kodiert: PRIME-Editierungstechnologie

Cédric Happi Mbakam

Mutationen im Dystrophin-Gen führen zu neuromuskulären Erkrankungen wie der Muskeldystrophie Duchenne, einer tödlichen, X-chromosomalen Erbkrankheit mit einer Prävalenz von 19,8 pro 100.000 männlichen Geburten. Derzeit verfügbare klinische Therapien mit Kortikosteroiden oder Morpholino-Antisense-Oligomer-Injektionen bieten nur begrenzte phänotypische Verbesserungen. Unsere Studie zielte darauf ab, die Effizienz der PRIME-Editing-Technologie zu messen. Diese Technologie verwendet ein PRIME-Editorplasmid (PE2 oder PE3), das für eine Reverse Transkriptase des Moloney-Mausleukämievirus kodiert, die mit der Cas9 H840A-Nickase fusioniert ist, und ein Plasmid, das für eine pegRNA kodiert, die Primerbindungsstellen (PBS) und eine Reverse-Transkriptase-Vorlage (RTT) enthält. Es ermöglicht spezifische Nukleotidsubstitutionen, -deletionen oder -insertionen im Genom. Wir haben verschiedene pegRNAs entwickelt, die auf mehrere hDMD-Exons (9, 20, 35, 43, 51, 55 und 61) abzielen, um durch Modifizierung eines einzelnen Nukleotids ein STOP-Codon einzuführen. HEK293T-Zellen wurden drei Tage nach gleichzeitiger Transfektion mit PE2 und pegRNA aus DMEM-Kulturmedien geerntet. Exons wurden mittels PCR amplifiziert und mit der Sanger-Methode sequenziert. Die Ergebnisse wurden mit dem Programm EditR analysiert, um den Editierungsprozentsatz zu schätzen. Wir haben bestätigt, dass die PRIME-Editierung die spezifischen C-zu-T- und G-zu-T-Substitutionen im DMD-Gen mit einer Editierungseffizienz zwischen 6 und 11 % (PE2) und 21 % (PE3) ermöglicht. Wiederholte Transfektionen 6 Tage nach der ersten zeigten eine bis zu 15 %ige (PE2) Änderung in den Exons 9 und 35. Eine zusätzliche Mutation in der PAM-Sequenz (Exon 35) verbesserte das PE2-Ergebnis bei einer einzigen Transfektion auf 38 %. Somit ermöglicht PRIMEediting die spezifischen Substitutionen im DMD-Gen und kann zur Korrektur von Punktmutationen im DMD-Gen verwendet werden, um zur Dystrophin-Expression zu führen.