Zeitschrift für klinische und experimentelle Ophthalmologie
Offener Zugang

Abstrakt

Verstärktes chromatographisches Signal und UV-Absorptionsspektroskopie zur Bewertung von Lysozym nach thermischer Denaturierung und in Kontaktlinsenextrakten

Claude J Giasson, Danielle Béland und Langis Michaud

Ziel: Verstärkung des Absorptionssignals für das aus Kontaktlinsen extrahierte Lysozym, gemessen mit Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC); Untersuchung der Reinheit des Lysozyms und des Einflusses der thermischen Denaturierung auf sein Elutionsprofil.
Methoden: In chromatographischen Probeläufen, bei denen Kontaktlinsenextrakte in das System injiziert wurden, wiesen die zwischen 4 und 5,5 Minuten gesammelten Fraktionen laut Western Blot auf Lysozym als eluierendes Protein hin. Die Proteine ​​wurden aus den Kontaktlinsen in einer 50:50-Lösung aus 0,2 % Trifluoressigsäure (TFA): Acetonitril (ACN) extrahiert. Jeder Kontaktlinsenextrakt wurde in 2 Aliquots aufgeteilt. Nach der Vakuumverdampfung wurden Aliquots Nr. 1 in der anfänglichen mobilen Phase aufgelöst, um einen Anreicherungsfaktor von 8 zu erzeugen. Aliquots Nr. 2 blieben unbehandelt in der normalen Extraktionslösung. Durch Kalibrierung des Absorptionssignals bei 220 nm konnten die Lysozymwerte in Chromatogrammen gemessen werden. Durch parallele Injektionen beider Aliquots in die HPLC konnte ihr Lysozymgehalt verglichen werden. Die Reinheit des extrahierten Lysozyms wurde durch Betrachtung seines Absorptionsspektrums über die Peaks hinweg bewertet. Auf 80 und 100 °C erhitzte Lysozymlösungen wurden injiziert und mit Kontrolllösungen verglichen. Unterschiede im mittleren Lysozymgehalt zwischen den Aliquots Nr. 1 und 2 und im Peakbereich des erhitzten Lysozyms im Vergleich zur Kontrolllösung wurden mit nichtparametrischen Methoden geprüft.
Ergebnisse: Der in angereicherten und normalen Extrakten gemessene mittlere Lysozymspiegel unterschieden sich erheblich (39,8 bzw. 21,5 μg). Nach Korrektur für unterschiedliche Injektionsvolumina und Konzentrationsfaktoren lag der mittlere angereicherte Lysozymspiegel (21,4 μg) jedoch nahe an dem im normalen Extrakt gefundenen Spiegel. Die Beobachtung der spektralen Absorption weist darauf hin, dass das eluierende Lysozym frei von Verunreinigungen ist. Die mittleren Verhältnisse der Peakflächen von erhitztem Lysozym gegenüber der Peakfläche von Kontrolllysozym unterschieden sich bei einer Temperatur von 100 °C (0,91) signifikant von 1, jedoch nicht bei einer Temperatur von 80 °C (0,95) mit dem Vorzeichen-Rang-Test. Sogar bei Erhitzung auf 80 °C erschien das Elutionsprofil von Lysozym im Vergleich zur Kontrolle weniger symmetrisch und wies einen zusätzlichen Wendepunkt auf. Diese subtilen Änderungen verstärkten sich bei 100 °C.
Schlussfolgerung: Die Anreicherung des aus Kontaktlinsen extrahierten und in der anfänglichen mobilen Phase gelösten Lysozyms verbessert die Empfindlichkeit dieses chromatographischen Verfahrens. Dieses chromatographische Protokoll in Verbindung mit UV-Absorptionsspektroskopie kann thermische Denaturierung bei 80 und 100 °C erkennen.