Zeitschrift für antivirale und antiretrovirale Medikamente
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Abstrakt

Klonierung, Expression und Reinigung rekombinanter Formen des vollständigen und extrazellulären EBOV-Glykoproteins in Säugetierzelllinien

Misaki Wayengera, Peace Babirye, Carol Musubika, Samuel Kirimunda, Moses L. Joloba

Hintergrund: Das vollständige Ebolavirus- Glykoprotein (GP) durchdringt die äußerste Lipidmembran und bildet Spikes, wo es die Interaktion zwischen Virus und Wirtszelle vermittelt. Eine sekretorische Form von GP (sGP) wird auch von allen 5 bekannten Ebolavirusarten produziert . Diese Eigenschaften machen GP zu einem idealen Ziel für Forschung und Entwicklung (F&E) von auf Ebolavirus und möglicherweise Panfiloviren ausgerichteten Schnelldiagnosetests (RDTs), Biotherapeutika und Impfstoffen. Bei früheren Klonierungen von rekombinantem Zaire- Ebolavirus ( EBOV )-GP wurden hauptsächlich Expressionssysteme von Insekten ( Baculoviren ) verwendet . Wir berichten über die Klonierung, Expression und Reinigung der vollständigen und extrazellulären Domänenformen (ECD) von rekombinantem EBOV-GP in Säugetierzelllinien.

Methoden und Ergebnisse: 2034 und 1956 Basenpaare (bp) umfassende codierende DNA-Sequenzen, die den 669 und 643 Aminosäuren (aa) der Volllängen- und ECD-Formen von EBOV GP entsprechen, wurden in die pTGE-Plasmide subkloniert. Rekombinante pTGE-Plasmide wurden verwendet, um 293-6E HEK-Säugetierzellen zu transfizieren, die in serumfreiem FreeStyleTM 293-Expressionsmedium gezüchtet wurden. Zelllysate und/oder Kulturüberstände wurden verwendet, um gereinigtes Protein zu erhalten, gefolgt von einer Analyse per SDS-PAGE und Western Blot. Gereinigtes GP in voller Länge wurde als membrangebundenes Protein in Zelllysaten mit einem geschätzten Molekulargewicht von ~100 kDa (Cal.MW~71,67 kDa) per Western Blot nachgewiesen; und 0,02 mg GP (Konzentration: 0,2 mg/ml, Reinheit: ~50 %) wurden gewonnen. Im Gegenteil, ECD GP wurde in Überständen der Zellkulturbrühe mit einem geschätzten Molekulargewicht von ~116 kDa basierend auf SDS-PAGE und Western Blot nachgewiesen; und es wurden 1,6 mg (Konzentration: 0,4 mg/ml, Reinheit: ~70 %) GP_ECD gewonnen.

Schlussfolgerung: In Säugetierzellen wird rekombinantes EBOV GP in voller Länge überwiegend als Transmembranprotein (tGP) exprimiert, während ECD GP in das Kulturmedium eluiert wird. Beide rekombinanten Formen von GP sind für die Forschung und Entwicklung von Schnelldiagnosetests (RDTs) von entscheidender Bedeutung.