Zeitschrift für Angewandte Pharmazie
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Abstrakt

Koexpression des gentechnisch veränderten Cyt b5-CYP3A4-Fusionsproteins mit POR in Sf9-Insektenzellen und funktionelle Charakterisierung der exprimierten Produkte in vitro

Zhangming Xie, Shabbir Ahmed, Wenhui Liu, Sisi Kong, Yingchun Xu, Ting Liu und Shuqing Chen

Menschliches Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) ist das am häufigsten vorkommende Arzneimittel-metabolisierende Enzym der Phase I in der Leber, und etwa 50 % der auf dem Markt erhältlichen Arzneimittel werden durch CYP3A4 metabolisiert. Daher stützten sich viele In-vitro-Studien auf rekombinantes CYP3A4 als Screening-Tool, um potenzielle Arzneimittelwechselwirkungen (DDIs) in vivo zu bewerten. Zu rekombinantem CYP3A4 mit hoher katalytischer Aktivität sind jedoch nur begrenzte Informationen verfügbar. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, rekombinantes CYP3A4 mit hoher katalytischer Aktivität zu erhalten und seine Funktionen in vitro zu charakterisieren. Um die katalytischen Aktivitäten von heterolog exprimiertem CYP3A4 zu steigern, wurde das Enzym von Schwanz zu Kopf mit Cytochrom b5 (b5) fusioniert und das fusionierte Enzym zusammen mit NADPH-P450-Reduktase (POR) in ein einzelnes Plasmid eingefügt, um eine gleichzeitige Expression in sf9-Zellen zu erreichen. Hier wurden Substratbindungsaffinitäten, enzymatische Aktivitäten und Anwendungen in in vitro DDIs des fusionierten Enzyms untersucht. Die Dissoziationskonstante Kd von POR-cyt b5CYP3A4 betrug 8,3 ± 0,87 μmol/L, die Clint (Clint=Vmax/Km) betrug 8,57 mL/min/g Protein für POR-cyt b5CYP3A4 im Metabolismus von Testosteron und 150,3 mL/min/g Protein für Midazolam. Darüber hinaus betrug die Hemmkonstante Ki von Ketoconazol auf den Testosteronmetabolismus 0,013 ± 0,0038 μmol/L. Die vorliegenden Ergebnisse deuten auf eine signifikant erhöhte Substratbindungsaffinität und enzymatische Aktivität des fusionierten Enzyms hin. Daher könnte das Konstrukt für die Untersuchung des Arzneimittelmetabolismus und der DDI-Untersuchung im Zusammenhang mit CYP3A4 in vitro hilfreich sein. Darüber hinaus könnte die gleichzeitige Expression des fusionierten Enzyms und von POR aufgrund eines stabileren Molarverhältnisses von CYP3A4/POR/b5 reproduzierbarere Ergebnisse liefern.