Zeitschrift für Zellwissenschaft und Therapie
Offener Zugang

Abstrakt

Design und molekulare Charakterisierung des C-Kit-Transgenkonstrukts während der Spermatogenese bei Mäusen

Swanand Koli, Arun P. Sikarwar, Murali R. Babu und Reddy KVR

In den postnatalen Hoden differenzieren sich undifferenzierte spermatogonische Stammzellen (SSCs) vom Typ A in Gegenwart von c-Kit, das während der Spermatogenese bei Säugetieren zell-/stadiumspezifisch exprimiert wird, in Spermatogonienzellen (SGCs) vom Typ B. c-Kit unterliegt einer strengen transkriptionellen Kontrolle, da es nicht nur für Keimzellen, sondern auch für die Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen und Melanozyten wichtig ist. Obwohl die Expression von c-Kit ein dynamisch regulierter Prozess ist, ist die molekulare Grundlage seiner transkriptionellen Regulierung während der Spermatogenese weitgehend unbekannt. Ziel der Studie ist es, festzustellen, ob die Einführung eines c-Kit exprimierenden Transgenkonstrukts in c-Kit-negative SSCs, die aus Wv/Wv-Mutantenmäusen isoliert wurden, sich in den Hoden der Empfängermäuse differenziert und ansiedelt. Zu diesem Zweck wurde ein 7,4 kb langes pG1-Kit-ORF-GFP-Transgenkonstrukt entwickelt, das eine 4,4 kb lange c-Kit-ORFGFP-Expressionskassette enthält, und seine In-vitro-Expression wurde durch Immunfluoreszenz- und Durchflusszytometrieanalyse bestätigt. Zum Vergleich der Ergebnisse wurden drei Kontroll-GFP-Konstrukte mit 1,1 kb (ohne c-Kit-Promotor und ORF), 4,1 kb (ohne c-Kit-Promotor) und 1,4 kb (ohne c-kit-ORF) entwickelt und durch Elektroporation (EP) in SSCs eingeführt. Diese SSCs wurden mithilfe einer Keimzelltransplantation (GCT) über das Netz in die Hoden von mit Busulfan behandelten unfruchtbaren Empfängermäusen eingeführt. Es wurde beobachtet, dass SSCs mit dem c-Kit-ORF-GFP-Transgen-Insert im Vergleich zu Kontrollmäusen in der Lage waren, die Samenkanälchen der Empfängermäuse zu besiedeln und in andere Keimzelllinien zu differenzieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hoden-Wv/Wv-Mutantenmäuse eine Population von SSCs aufweisen, bei denen die Funktion der c-Kit-Signalisierung zum ersten Mal beeinträchtigt ist. Wir berichten, dass die SSC-Funktion in den unfruchtbaren Empfängermäusen durch die Einführung des c-Kit-ORF-GFP-Transgeninserts wieder aufgenommen werden konnte. Daher könnten die vorliegenden Erkenntnisse einen erheblichen Einfluss auf das Verständnis der Fortpflanzungsphysiologie und das Potenzial für neuartige zukünftige Therapien bei Patienten mit Hodenversagen haben.