Fortpflanzungssystem und sexuelle Störungen: Aktuelle Forschung
Offener Zugang
ISSN: 2161-038X
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Ewa L Gregoraszczuk
Abstrakt
Ein typischer Befund in Krebszellen ist die Überexpression von Histon-Deacetylasen (HDACs), die zu einer veränderten Artikulation und Bewegung verschiedener Proteine führt, die mit der Karzinogenese in Zusammenhang stehen. Da Leptin den Grad der HDACs regulieren kann, haben wir die Theorie aufgestellt, dass Leptinrezeptor-Gegner die HDAC-Artikulation verändern können.
Materialien und Methoden : Die HDAC-Artikulation in Zellen, die Leptin und Leptinrezeptor-Feinden (SHLA und Lan2) ausgesetzt waren, wurde in Eierstockepithel- und Follikulomzellen (COV434, KGN) untersucht.
Ergebnisse : In Epithelzellen wurde im Vergleich zu Follikulomzellen eine höhere HDAC-Artikulation festgestellt. Leptin erhöhte HDACs der Klassen I und II nur in OVCAR-3-Zellen, und SHLA war stärker als Lan-2. In Follikulomzellen erhöhte Leptin nur die HDAC-Artikulation der Klasse II; Lan-2 war in COV434 stärker als SHLA, und keiner der Antagonisten beeinflusste die KGN-Zellen.
Schlussfolgerung : SHLA und Lan2 eliminieren die negativen Auswirkungen von Leptin auf die HDAC-Artikulation auf zelltypspezifische Weise. Dies ist der erste Bericht über die Erprobung von Leptinrezeptorblockern als HDAC-Inhibitoren in Eierstockkrebszellen.
Schlüsselwörter: Eierstockkrebs, Leptin, Leptinrezeptorblocker, HDAC-Expression
Einleitung: Epigenetische Veränderungen wie posttranslationale Histonveränderungen können eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung spielen. Zwei Gruppen von Molekülen sind für die Acetylierungsreaktion von Histonen verantwortlich: Histonacetylasen (HATs) und Histondeacetylasen (HDACs). Der Vorsprung der HDACs gegenüber den HATs führte zur Einschränkung der Liste einiger für die Tarnung der Karzinogenese verantwortlicher Gene. Darüber hinaus sind HDACs auch für die Deacetylierung von Nicht-Histon-Proteinen verantwortlich, die den Zellzyklus, die Zellteilung und die Apoptose steuern. Säugetier-HDACs werden in vier Klassen unterteilt. HDACs 1, 2, 3 und 8 bilden Klasse I. HDACs 4-7, 9 und 10 bilden Klasse II. HDACs der Klasse III sind NAD+-substituierte Moleküle, auch Sirtuine (SIRTs) genannt. HDAC11, das erste Mitglied der HDACs der Klasse IV, vereint die Eigenschaften der Klassen I und II.
Ein häufiges Ergebnis bei Krebszellen ist die Überexpression von HDACs und ihre erhöhte Aktivität, was zu einer veränderten Expression und Aktivität verschiedener Proteine führt, die mit der Krebsentstehung in Zusammenhang stehen. Obwohl das Wissen über Eierstockkrebs wächst, gibt es noch immer keine geeignete Behandlung zur Vorbeugung und Behandlung dieser Krebsart. Es gibt eine wachsende Zahl von Beweisen, die darauf hinweisen, dass die Freisetzung von HDACs der Klasse I bei Eierstockkrebs erhöht ist, und dies ist nicht nur damit verbunden, dass sie eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung spielen, sondern auch zur Resistenz gegen Chemotherapeutika beitragen, die zur Behandlung von Eierstockkrebs eingesetzt werden. Jin et al. haben gezeigt, dass HDACs
der Klasse I werden in Eierstockkrebsproben im Vergleich zu Proben von gesunden Personen überexprimiert. Hayashi et al. haben herausgefunden, dass in den vielen von Patienten mit Eierstockkrebs gewonnenen Gewebeproben HDAC1 und HDAC2 hauptsächlich an der Ausbreitung von Krebszellen beteiligt sind, während HDAC3 mit Zellbewegungsmustern in Zusammenhang steht. Die Blockierung von HDAC3 führt zur Blockierung der Ausbreitung von Krebszellen. Ebenso ist die HDAC-Aussprache bei Patienten mit Eierstockkrebs erhöht, der gegen eine Chemotherapie auf Platinbasis resistent ist. Ebenso sind HDAC4 und HDAC6 mit der Blockierung und Ausbreitung von Eierstockkrebs verbunden. Lapinska et al. haben gezeigt, dass kombinierte Behandlungen mit HDAC-Inhibitoren gegen verschiedene Arten von Eierstockkrebs wirksam sein können.
Materialen und Methoden
Materialien : Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium/Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F-12) wurde von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) von Gibco bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), RPMI-1640, fetales Ochsenserum (FBS, hitzeinaktiviert), Penicillin und Streptomycin wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen. Leptin wurde von Sigma Chemical Co. bezogen. Leptinrezeptor-Gegner (SHLA, Lan1 und Lan2) wurden von Protein Laboratories Rehovot (PLR) Ltd. (Rehovot, Israel) bezogen.
Zellkultur : OVCAR-3 (hergestellt aus der schädlichen Aszites einer Patientin mit dynamischem Adenokarzinom des Eierstocks nach kombinierter Chemotherapie mit Cyclophosphamid) und CaOV-3 (eine essentielle Eierstockkrebs-Zelllinie) wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen. COV434-Zellen wurden von der Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen. Die biologischen Eigenschaften dieser Zelllinie wurden kürzlich beschrieben (20). KGN-Zellen wurden von Masatoshi Nomura und Hajime Nawata, Kyushu University, Japan, bezogen (21). CaOV-3-Zellen wurden routinemäßig in DMEM mit 10 % FBS und OVCAR-3 in RPMI-1640, angereichert mit 20 % FBS, raffiniert. COV434-Zellen wurden routinemäßig in DMEM + 2 mM Glutamin + 10 % FBS raffiniert. KGN-Zellen wurden routinemäßig in DMEM/F-12 + 10 % FBS raffiniert. Die Zellen wurden in 75 cm2 großen Gewebekulturschalen (Nunc, Dänemark) in einer 37 °C warmen Brüterei mit einer befeuchteten Mischung aus 5 % CO2 und 95 % Luft entwickelt.
qPCR-Analyse : Die basale HDAC-Qualitätsartikulation und die Deklaration der von Leptin und Leptinkonkurrenten beeinflussten HDAC-Qualitäten wurde durch qPCR bestimmt. Die Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten mit einer Dichte von 1,5 × 104 Zellen/Well (CaOV-3), 1,5 × 103 Zellen/Well (OVCAR-3), 8 × 103 Zellen/Well (COV434) und 1,5 × 104 Zellen/Well (KGN) ausgesät, wobei die Zellgröße und die Populationsvermehrungszeit berücksichtigt wurden. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt und die Zellen wurden mit Leptin in einer Dosierung von 40 ng/ml allein oder mit SHLA und Leptin behandelt.
Western-Blot-Analyse : Die Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dicke von 2×105 (CaOV-3), 3,5×104 (OVCAR-3-Zellen), 4×104 (COV434-Zellen) und 6×104 (KGN-Zellen) plattiert und durften sich vorerst verbinden. Am nächsten Tag wurde das Medium gewechselt und die Zellen wurden mit 40 μg/ml Leptin allein oder in Kombination mit 1.000 μg/ml SHLA oder Lan2 behandelt. Um die HDAC-Protein-Artikulation zu untersuchen, wurden die Zellen 48 Stunden lang geschlüpft. Nach dem Brüten wurden die Zellen mit superkaltem PBS gewaschen und mit Laemmli-Lyse-Cradle (Sigma Chemical Co.) lysiert. Die lysierten Zellen wurden dann abgekratzt, in Mikroröhrchen überführt und bis zur Analyse bei –70 °C aufbewahrt.
Gleiche Mengen an Protein (50 μg) aus jeder Behandlungsgruppe wurden durch SDS-PAGE isoliert und mithilfe des Bio-Rad Mini-Protean 3-Mechanismus (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) auf PVDF-Schichten übertragen. Die Schichten wurden eine Zeit lang mit essentiellen Antikörpern, die spezifisch für HDAC5, HDAC6 und HDAC7 sind (#20458S, #7558S, #33418S Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, USA), bei einer Verdünnung von 1:1.000 gezüchtet. Nach dem Schlüpfen mit der essentiellen Immunantwort wurden die Schichten mehrmals mit 0,1 % Tween-20 in 0,02 M TBS-Kissen gewaschen und 1 Stunde lang mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Hilfsantikörper (#7074 Cell Signaling Technology Inc.; Verdünnung 1:2.000) gezüchtet.
Histon-Deacetylase-Aktivitätstest : Die HDAC-Aktivität wurde mit dem In Situ HDAC Activity Fluorometric Assay Kit (EPI003, Sigma Chemical Co.) gemessen. Die Messungen des fluoreszierenden Produkts wurden mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser (FLx800 Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) bei einer Anregungsfrequenz von 368 nm und einer Abflussfrequenz von 442 nm gemessen. Alle Proben wurden in vierfacher Ausfertigung bei derselben Untersuchung durchgeführt.
Statistische Analyse : Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM aus den vier unabhängigen, dreifach durchgeführten Studien angegeben. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 5 durchgeführt. Die Daten wurden mithilfe einer zweigleisigen Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von einem Tukey-Test mit theoretisch kritischem Kontrast (HSD) und verschiedenen Spannweiten. Ein Wert von p<0,05 wurde als theoretisch kritisch angesehen.
Ergebnisse: Einfluss von Leptin und Leptinrezeptor-Gegnern auf die HDAC-Genausowie die Protein-Expression in Eierstockkrebszellen. In der OVCAR-3-Zelllinie war die Expression aller untersuchten HDACs insgesamt höher als in CaOV-3-Zellen, wobei die höchste Expression für HDACs 1, 2, 3 und 7 festgestellt wurde. Leptin erhöhte die Expression der HDAC-Gene 1, 7 und 9. Von den verwendeten Blockern kehrte SHLA nicht nur die stimulierende Wirkung von Leptin auf die HDAC-Gene 1 und 9 und Proteine um, sondern verringerte auch die Expression des HDAC-Gens 4, des HDAC-Gens 5 und Proteins und des HDAC6-Proteins. Lan-2 hatte keinen Einfluss auf die HDAC-Genowiesowie, es wurde jedoch eine starke hemmende Wirkung auf die Expression des HDAC9-Proteins festgestellt.
Diskussion: Die erhöhte Expression verschiedener Proteine der HDAC-Klasse wurde bei 60 – 90 % der Eierstocktumoren nachgewiesen und es wurden zahlreiche Histon- und Nicht-Histon-bedingte Veränderungen beschrieben, die das Gleichgewicht für Zellwachstum und Überleben verändern.
Die vorgestellten Daten zeigten deutlich eine insgesamt höhere HDAC-Qualitätsartikulation in Epithelzellen als in Granulosazellen. Außerdem zeigten sie, dass in der chemoresistenten OVCAR-3-Zelllinie der Ausfluss aller untersuchten HDACs deutlich höher war als in essentiellen CaOV-3-Zellen, wobei die höchste Artikulation für HDACs 1, 2, 3 und 7 festgestellt wurde. In Granulosatumorzellen wurde im erwachsenen Gewebe eine geringere HDAC-Artikulation beobachtet als im jugendlichen Gewebe, wobei die höchste Artikulation von HDAC9 in COV434-Zellen gefunden wurde. Mit Ausnahme der hohen Artikulation von HDAC7 in OVCAR-3 und HDAC9 in COV434 aus Klasse II war die Aussage von HDACs aus Klasse I in allen Fällen höher als aus Klasse II. Die meisten Studien zeigten eine verbesserte Artikulation von HDACs der Klasse I in stabilen menschlichen Tumoren und in privat entwickelten, dedifferenzierten, sich stark vermehrenden Tumoren. Es gibt eine wachsende Sammlung von Beweisen dafür, dass der Ausfluss von HDACs der Klasse I bei Eierstockkarzinomen erhöht ist, und dies ist nicht nur mit der Übernahme einer bemerkenswerten Rolle bei der Karzinogenese verbunden, sondern zusätzlich mit
Beitrag zum Schutz vor Chemotherapeutika, die zur Förderung des Eierstockkrebswachstums eingesetzt werden. Dies steht im Einklang mit unserer Wahrnehmung, dass die höchste Expression in OVCAR-3-Zellen beobachtet wurde.
Diese Arbeit wird teilweise auf dem 29. Euro-Global Summit on Cancer Therapy & Radiation Oncology vom 23. bis 25. Juli 2018 in Rom, Italien, vorgestellt.