Immunomforschung
Offener Zugang

Abstrakt

Funktionelle rekombinante MHC-Klasse-II-Moleküle und Hochdurchsatz-Peptidbindungstests

Sune Justesen, Mikkel Harndahl, Kasper Lamberth, Lise-Lotte B. Nielsen

Hintergrund: Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC-II) der Klasse II binden spezifisch an CD4+-T-Helferzellen und präsentieren ihnen exogen gewonnene Peptidepitope. Der extreme Polymorphismus des MHC-II erschwert die vollständige Analyse der Peptidbindung. Er stellt zudem ein erhebliches Hindernis bei der Erzeugung von MHC-II-Molekülen als Reagenzien zur Untersuchung und Manipulation spezifischer T-Helferzell-Reaktionen dar. Methoden zur rekombinanten Erzeugung funktioneller MHC-II-Moleküle und zur Messung ihrer Interaktion mit Peptiden wären äußerst wünschenswert; es gibt jedoch noch keine einheitliche Methode. Ergebnisse: Wir haben α- und β-MHC-II-Kettenkonstrukte erzeugt, bei denen die membrandurchspannenden Regionen durch Dimerisierungsmotive ersetzt und das C-Terminus der β-Ketten mit einem Biotinylierungssignalpeptid (BSP) fusioniert wurde, was eine Biotinylierung in vivo ermöglicht. Diese Ketten wurden separat als Einschlusskörper in E. coli hergestellt, in Harnstoff extrahiert und unter denaturierenden und nichtreduzierenden Bedingungen mittels konventioneller Säulenchromatographie gereinigt. Anschließend führte das Verdünnen der beiden Ketten in einer Faltungsreaktion mit dem entsprechenden Peptid zu einer effizienten Peptid-MHC-II-Komplexbildung. Es wurden mehrere verschiedene Formate für Peptidbindungstests entwickelt, darunter ein homogener, nicht radioaktiver Hochdurchsatz-Bindungstest (HTS). Es wurden Bindungsisothermen erzeugt, mit denen die Affinitäten der Interaktion bestimmt werden konnten. Die Affinitäten der besten Binder lagen im niedrigen nanomolaren Bereich. Rekombinante MHC-II-Moleküle und der zugehörige HTS-Peptidbindungstest wurden erfolgreich für neun verschiedene MHC-II-Moleküle entwickelt, darunter DPA1*0103/DPB1*0401 (DP401) und DQA1*0501/DQB1*0201, bei denen sowohl die α- als auch die β-Ketten polymorph sind, was die Vorteile der getrennten Herstellung der beiden Ketten verdeutlicht. Fazit: Wir haben erfolgreich vielseitige MHC-II-Ressourcen entwickelt, die bei der Erzeugung von MHC-Klasse-II-weiten Reagenzien, Daten und Werkzeugen helfen können.