Fortschritte in der Gentechnik
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Abstrakt

Genomik 2019: Quantitative Gen- und Umweltinteraktionen bei Flussgarnelen, Macrobrachium rosenbergii, vom Labor bis zur Zucht

Tahereh Alinejad

In dieser Studie wurde der Einfluss von Wassertemperatur und Umweltfaktoren auf die Immunantwort bei der Flussgarnele (Macrobrachium rosenbergii) anhand von fünfzehn grundlegenden Immunantwortmerkmalen beurteilt. Das Merkmal wurde anhand unserer früheren Forschung zu Transkriptomdaten und Proteom von M. rosenbergii ausgewählt und geplant. Labortests zum Einfluss unterschiedlicher Temperaturen auf die Flussgarnelen wurden im natürlichen Lebensraum der Flussgarnelenfarm durchgeführt. Für die Studie wurden zwei verschiedene Farmen gemäß der üblichen und nicht üblichen Verwaltungs- und Ausrüstungspraxis ausgewählt. Verschiedene Tests wurden zu verschiedenen Tageszeiten bei unterschiedlichen Wassertemperaturen von 24 °C bis 32 °C durchgeführt. Die Immunantwort des Süßwassergarnelen-Immunsystems gegen Hitzeschock und die Managementsysteme wurde durch Anwendung eines differenziellen Immunantwortprofils (Fluidigm Biomark HD) in drei verschiedenen Organen, nämlich Serum, Hepatopankreas und Muskel, untersucht. Das Ergebnis bestätigte, dass steigende Wassertemperaturen die Immunantwort von Flussgarnelen direkt beeinflussen. Ebenso wurde der Einfluss unterschiedlicher Wassertemperaturen auf die Immunitätsübertragung im Serum, Hepatopankreas und Muskel von Süßwassergarnelen durch eine Analyse der differenziellen Immunitätsübertragung untersucht. Eine Korrelation der Immunitätsübertragungsdaten der drei Gruppen zeigte, dass die kodierenden Immunitätspfade im Vergleich zu Temperaturanstieg im Wesentlichen herunterreguliert und die kodierenden Metaboliten im Wesentlichen hochreguliert waren. Unsere Untersuchung ergab eine neue Immunitätsverbindung im Lektinpfad, nämlich Tachylektin, als ein weiteres potenzielles Konkurrenzmerkmal für die Entwicklung von Umweltstressmarkern in Süßwassergarnelen. Diese Untersuchung lieferte außerdem wichtige Daten zur differenziellen Übertragung des Immunitätspfads von Riesen-Neuseegarnelen nach Umweltstress, die dazu beitragen werden, das Verständnis der Immunitätsklimaverbindungen bei dieser Art zu verbessern, indem 15 Merkmale verwendet werden, die aus in früheren Untersuchungen gewonnenen Transkriptomdaten entwickelt wurden. Darüber hinaus lieferte die Farm-Umweltanalyse wichtige Daten über die Auswirkungen des Boden- und Wassergehalts, des Garnelenfutters und der Farmmanagementtechniken auf die Entwicklung der Immunität und den Farmertrag von Süßwassergarnelen.

In letzter Zeit sind Hochdurchsatztechnologien wie die hochmoderne Sequenzierung (NGS) aufgekommen und werden sowohl in der Genom- als auch in der Transkriptomforschung häufig eingesetzt. Die NGS-Technologie kann auch verwendet werden, um die differenzielle Expression verschiedener Gewebe oder bestimmter Bedingungen wie Stress und Bakterieninfektionen sowohl in Modell- als auch in Nicht-Modell-Lebensformen zu untersuchen. Es gibt Transkriptom-Reads für Penaeidae-Garnelen wie Peneaus monodon, Litopeneaus vannamei, Fenneropeneaus chinensis, Fenneropenaeus merguiensis und Marsupeneaus japonicus, um die gewebespezifische Expression, die Stressreaktion und Virusinfektionen zu untersuchen. Darüber hinaus wurden zahlreiche Untersuchungen zur vollständigen Transkriptomsequenzierung des Hepatopankreas von M. rosenbergii aufgrund einer Infektion mit Vibrio parahaemolyticus, des Hepatopankreas und des Lymphsystems aufgrund einer Infektion mit der Weißfleckenkrankheit (WSSV) und des Darmgewebes aufgrund von WSSV oder der viralen PAMP-Kopie (Poly I:C) durchgeführt. Zuletzt wurde eine Transkriptomanalyse des hämatopoetischen Gewebes von erwachsenen Garnelen mit M. rosenbergii aufgrund einer Infektion mit MrNV in Betracht gezogen. Eine große Anzahl unterschiedlich reichhaltiger Datensätze wurde mit verschiedenen sicheren Instrumenten erstellt, beispielsweise Mustererkennungsrezeptoren, Antioxidantien und antimikrobiellen Peptiden.

Um differenziell hoch dotierte Datensätze zu identifizieren, die mit einer MrNV-Infektion in Zusammenhang stehen, führten wir eine RNA-Sequenzierung an sechs Replikaten jedes soliden PL und des vorläufig mit MrNV infizierten PL durch. Die Ergebnisse zeigten, dass 5538 Datensätze differenziell kommuniziert wurden, wobei 2413 Datensätze hochreguliert und 3125 Datensätze herunterreguliert wurden. Von diesen Datensätzen waren einige aufgrund einer Virusinfektion mit dem natürlichen Immunsystem in Konflikt geraten.

Um unsere Ergebnisse aus der Datensammlung und der differenziellen Fülle zu bestätigen, wählten wir auch 9 Punkte für die Bestätigung mit qPCR aus und zeigten eine niedrige Falscherkennungsrate in diesen Bereichen. Wir filterten unsere Liste der DEGs nach funktionellen Bedeutungsgruppen, darunter Mustererkennungsproteine ​​(PRPs) und antivirale Proteine, Prophenoloxidase (ProPO)-System, Toll-IMD-Signalwege, antimikrobielle Peptide (AMPs) und Blutgerinnungssystem, Phagozytose und Apoptose, Antioxidationsmittelsystem und RNA-Impedanz (RNAi). Mehrere Analysen zeigten eine hohe Korrelation zwischen RNAseq- und qPCR-Daten. Darüber hinaus zeigten RNAseq-Analysen von M. rosenbergii aufgrund bakterieller und viraler Infektion ebenfalls eine hohe Korrelation zwischen RNAseq- und qPCR-Ergebnissen. Um unsere Gewissheit zu erhöhen, bestätigten wir diese Ergebnisse in freien Bioproben. Die Blutgerinnung ist eine humorale Reaktion, die Hämolymphverlust und mikrobielle Ausbreitung während einer Verletzung verhindert. Bei Aasfressern umfasst die Blutgerinnung die Quervernetzung aller Gerinnungsproteine ​​(CPs) durch die von den Hämozyten freigesetzte kalziumsubstituierte Transglutaminase (TGase). Frühere Untersuchungen zeigten, dass die Lysozym- und Crustin-Synthese in M. japonicus in TGase-armen Garnelen herunterreguliert waren, was darauf hindeutet, dass es eine Verbindung zwischen dem Blutgerinnungssystem und AMPs gibt. Wir fanden heraus, dass die Transglutaminase- und Hemicentin-1-ähnliche Isoform X2 (HMCN1)-Synthese hochreguliert war. Außerdem bestätigten wir die Expression von HMCN1, das in der RNAseq um das 5,31-Fache und durch qPCR um das 16,07-Fache hochreguliert war. Diese Ergebnisse legten nahe, dass diese beiden Blutgerinnungskomponenten als Reaktion auf die Infektion mit MrNV einbezogen werden. Darüber hinaus könnte die Erhöhung der Konzentration zweier Blutgerinnungsbestandteile, Lysozym und bestimmter Isoformen von Crustin, einen Zusammenhang zwischen dem Blutgerinnungssystem und AMPs in M. rosenbergii nachweisen.