Zeitschrift für Physikalische Chemie und Biophysik
Offener Zugang

Abstrakt

Hochauflösende Einzelmolekülstruktur durch Elektronenmikroskopie und Einzelpartikel-Elektronentomographie enthüllt

Lei Zhang und Gang Ren

Das Protein ist in Lösung von Natur aus dynamisch und heterogen. Die Proteindynamik umfasst sowohl Gleichgewichtsschwankungen, die die biologische Funktion regulieren, als auch andere Nichtgleichgewichtseffekte biologischer Motoren, die chemische Energie in mechanische Energie umwandeln. Eine einzelne, einzigartige Proteinstruktur, die durch Röntgenkristalle und herkömmliche Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie bestimmt wurde, reicht jedoch nicht aus, um die dynamische Natur von Proteinen in Lösung zu erfassen. Die Strukturbestimmung von dynamischem und heterogenem Protein erfordert im Wesentlichen die Bestimmung jedes einzelnen Proteinpartikels. Kürzlich veröffentlichten Dr. Gang Ren und Dr. Lei Zhan die ersten dreidimensionalen (3D) EM-Bilder einzelner Moleküle, die jemals mit ausreichender Klarheit erhalten wurden, um ihre Struktur zu bestimmen, einen IgG-Antikörper (14 Å Auflösung) und ein 17 nm HDL (36 Å Auflösung). Diese Ergebnisse beruhten auf vier Neuerungen: i) Verbesserte Probenvorbereitung für die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Betriebsbedingungen für die Elektronenmikroskopie (EM) führten zur erfolgreichen Abbildung eines 17 nm großen HDL-Partikels (120 - 200 kDa) durch Kryo-Elektronentomografie (Kryo-ET); ii) Entwicklung eines optimierten NS-Protokolls (OpNS), das das Rouleau-Artefakt eliminiert, das die EM-Forschung seit drei Jahrzehnten plagt. Dieses OpNS-Protokoll liefert kontrastreiche Bilder einzelner Lipoproteine ​​mit ähnlicher Größe (<5 %) und Form (<5 %) wie die Kryo-EM; iii) Entwicklung eines hochauflösenden und kontrastreichen Probenvorbereitungsprotokolls, der Kryo-Positiv-Färbung (Kryo-PS), das die direkte Visualisierung der Sekundärstruktur eines kleinen Proteins ermöglicht, wie etwa der β-Stränge in CETP und des helikalen Doppelgürtels von ApoA-I in sphärischem HDL; iv) entwickelte eine robuste tomographische Rekonstruktionsmethode, die Individual Particle Electron Tomography (IPET), eine hochauflösende, hochdurchsatzfähige Rekonstruktionsmethode, die unseres Wissens nach die einzige Methode zur Bestimmung einer einzelnen Proteinstruktur ist. Bemerkenswerterweise widersprach IPET der herkömmlichen Ansicht, dass ein einzelnes Protein NICHT durch EM rekonstruiert werden kann, und öffnet damit die Tür für die Untersuchung der Proteindynamik durch einen Strukturvergleich einzelner Partikel.