Zeitschrift für Proteomik und Bioinformatik
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Abstrakt

Interaktion des fluoreszenzmarkierten Cadherin G Protein-gekoppelten Rezeptors mit dem Cry1Ab-Toxin von Bacillus thuringiensis

Li Liu, Stefanie Boyd, Mehraban Kavoussi, Lee A. Bulla Jr. und Duane D. Winkler

Das von Bacillus thuringiensis produzierte Toxin Cry1Ab bindet an ein konserviertes Strukturmotiv im 12. Ektodomänenmodul (EC12) von BT-R1, einem Cadherin-G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), der in der Membran von Mitteldarm-Epithelzellen des Tabakschwärmers Manduca sexta enthalten ist . Die Bindung des Toxins überträgt ein Signal in die Zellen und aktiviert einen mehrstufigen Signalübertragungsweg, der zum Zelltod führt. Mithilfe chromatographisch gereinigter Cry1Ab- und EC12-Proteine ​​konnten wir die direkte Bildung eines stabilen Komplexes zwischen diesen beiden Proteinen in Lösung nachweisen und diesen auf einem nativen Polyacrylamidgel visualisieren. Darüber hinaus haben wir eine fluoreszierende EC12-Sonde erzeugt, indem wir den 36. Rest in Cystein umgewandelt haben, um eine maleimidvermittelte Konjugation des fluoreszierenden Farbstoffs Alexa-488 an EC12 durch zielgerichtete Mutagenese zu ermöglichen. Darüber hinaus haben wir den 44. Rest von EC12 durch Tryptophan ersetzt, was die Genauigkeit der Proteinquantifizierung und -rückverfolgbarkeit erheblich verbesserte. Mithilfe der fluoreszenzmarkierten EC12-Sonde für direkte und kompetitive Bindungstests konnten wir die Bindungsspezifität in Lösung bestimmen. Diese Erfolge werden die Identifizierung und Charakterisierung der Schnittstellensequenzen sowohl für das Cry1Ab-Toxin als auch für BT-R1 erleichtern.