Zeitschrift für Physikalische Chemie und Biophysik
Offener Zugang

Abstrakt

MJK2, ein K+-Kanal von M. Jannaschii vermittelt pH-abhängige Kaliumtransportaktivität

Carsten Zeilinger

MjK2 wurde in E. coli- Zellen als Fusionsprotein exprimiert, das am N- oder C-Terminus eine Antikörperbindungsstelle und ein Histidinhexamer enthält. Das C-terminal markierte Fusionsprotein ermöglicht die Expression und Reinigung einer zusätzlichen löslichen RCK-Domäne bei p34 kDa, während diese zusätzliche RCK-Domäne verloren ging, wenn das N-terminal markierte Konstrukt verwendet wurde. Nach Entfernung des Fusionspeptids aus dem gereinigten N-terminal markierten Kanalmonomer trat MjK2 als stabiles Tetramer auf, wenn es mit synthetischem Lipid inkubiert wurde. Die Kanalaktivität wurde nach Rekonstitution in Liposomen durch Einzelkanalaufzeichnung oder durch einen optischen Test mit dem Kalium-Sensorfarbstoff PBFI untersucht. Zunächst wurde die Kanalfunktion durch Einzelkanalaufzeichnung verbessert. Die Einzelkanalaufzeichnung bestätigte die pH-Abhängigkeit der Kanalaktivität mit Einzelkanalleitfähigkeiten von 42, 70, 85 und 202 pS und zeigte an, dass ein funktioneller K+-Kanal gebildet wurde. Um die Funktion der wiederhergestellten MjK2-Aktivität in einem optischen Test zu untersuchen, wurde die Kaliumfreisetzung eingeleitet, als die externe BaCl2-Blockade durch Zugabe von EDTA kompensiert wurde. Die Kaliumfreisetzung wurde durch wiederhergestelltes MjK2 bei niedrigem pH-Wert oder durch die Anwesenheit von internem Calcium bei hohem pH-Wert vermittelt. MgCl2 hatte keine oder nur eine schwache Wirkung, wohingegen cAMP bei niedrigem pH-Wert während der Herstellung einen vollständigen Kaliumverlust verursachte. Ausrichtungsstudien zeigten, dass MjK2 unterschiedliche Strukturmerkmale in der Kanalpore und der RCK-Zusammensetzung aufweist und daher eine andere Funktion zu erwarten ist. Aminosäuresequenz- und Strukturausrichtungen zeigten, dass eine Ca2+-Bindungsstelle und eine typische Nukleotid-Bindungsstelle in der RCK-Domäne von MjK2 nicht vorhanden sind und daher ein anderes Verhalten zu erwarten ist. Darüber hinaus kann eine Lysin-Reach-Linker-Region, wie sie in den K+-Kanälen hslo1 und hslo3 menschlicher Spermien vorkommt, eine ähnliche Rolle beim Gating-Verhalten spielen.