Immuntherapie:Offener Zugang
Offener Zugang

Abstrakt

Multiplex-Immunhistochemie: Die Bedeutung der Färbereihenfolge bei der Erstellung eines validierten Protokolls

Jihad Syed, Jack Ashton, Jesuchristopher Joseph, Gemma N. Jones, Christian Slater, Alan Sharpe, Garry Ashton, William Howat, Richard Byers, Helen K. Angell

Ziel: Die Komplexität multifaktorieller Erkrankungen wie Krebs stellt die Entwicklung personalisierter Therapien vor erhebliche Herausforderungen. Die integrierte digitale histologische Analyse von Tumoren ermöglicht ein besseres Verständnis des immunologischen Mikroumfelds und der prognostischen Beziehung, die mit der Zählung und Verteilung spezifischer Subpopulationen tumorinfiltrierender Lymphozyten (TILs) verbunden ist. Zu diesem Zweck wird neben der multispektralen Bildgebung (MSI) zunehmend die Multiplex-Zellmarkierung als Ansatz verwendet, um eine genauere In-situ-TIL-Phänotypisierung und -Quantifizierung zu erreichen. Diese Ansätze müssen jedoch vor ihrer Anwendung vollständig validiert werden, was das grundlegende Ziel dieser Studie ist.

Methoden: Ganze Abschnitte und Gewebemikroarrays von lymphozytenreichem Gewebe wurden verwendet, um ein Multiplex-Immunfluoreszenzprotokoll (IF) für die gleichzeitige MSI-Abfrage von bis zu sechs interessierenden Immunzellantigenen zu entwickeln und zu validieren: CD3, CD8, FOXP3, CD20, PD-L1 und PD1. Zunächst wurde eine Übereinstimmung zwischen der Single-Plex-Chromogen-Immunhistochemie (IHC) und der Single-Plex-Immunfluoreszenzfärbung (IF) erreicht. Anschließend wurde die Auswirkung der Position in einer Multiplex-IF-Reihenfolge für jeden beliebigen Antikörper untersucht, um die Auswirkungen der sterischen Hinderung des Antikörpers und der Bedingungen für die Antikörperentfernung zu verstehen.

Ergebnisse: Bei Verfahren, bei denen Multiplexing durch Antigen-Retrieval zum Entfernen vorheriger Antikörper ermöglicht wird, war der wichtigste zusammengesetzte Faktor, der die Validierung des Multiplex-Assays beeinflusste, der nichtlineare und ungleichmäßige Effekt verlängerter Zeiten der hitzeinduzierten Epitop-Retrievalierung (HIER), da die Antikörper in einem Multiplex-Protokoll der Reihe nach fortschreiten.

Schlussfolgerung: Diese Studie demonstriert die Genauigkeit der Multiplex-Färbung als repräsentativ für die Singleplex-Färbung, die Auswirkung der Reihenfolge der Antikörperfärbung und bietet einen Rahmen für die Erstellung optimierter Multiplex-Immunfluoreszenzprotokolle.