Journal of Glycomics & Lipidomics
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Abstrakt

N-Glycan-Analyse an monoklonalen Antikörpern mittels MALDI-Q-IT-TOF

Gulce Özmen

Monoklonale Antikörper (MAbs) werden zunehmend zur Behandlung von Krebs oder anderen Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Die korrekte Glykanstruktur von MAbs ist für die funktionelle und biologische Aktivität des entsprechenden Mabs von entscheidender Bedeutung, beispielsweise für die Identifizierung von Antigenen, die von Zellen des Immunsystems ausgelöst werden, die Regulierung der Signalaktivitäten und die physikochemischen Eigenschaften der produzierten Therapeutika usw. Daher ist eine schnelle Überwachung der Glykanstruktur für die Herstellung therapeutischer Arzneimittel, die Herstellung bioähnlicher Arzneimittel und deren Qualitätskontrollprozesse von entscheidender Bedeutung.

Das Hauptziel dieser Studie ist die Charakterisierung der Glykanstruktur von MAbs. In unserer Studie wurde die Glykanstruktur von Trastuzumab, das als Medikament zur Behandlung von Brustkrebs eingesetzt wird, charakterisiert. N-Glykane wurden enzymatisch durch Trypsinverdauung und PNGase F-Spaltung (Peptid: N-Glykosidase F) aus der Proteinstruktur von Trastuzumab freigesetzt. Darüber hinaus wurden spezielle Pufferaustausch- und Festphasenextraktionsverfahren zur Reinigung vor der MALDI-TOF-MS-Erkennung (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry) eingesetzt.

Nach der Entwicklung einer geeigneten Probenbehandlung und -optimierung wurden die Glykane GO, GOF, G1, G1F und GOF-GN eindeutig mittels MALDI-Q-IT-TOF MS erkannt, ohne dass eine Markierung oder zusätzliche chromatographische Trennmethoden erforderlich waren.

Der vorliegende Vortrag beschäftigt sich mit den theoretischen und experimentellen Aspekten von MALDI-Q-IT-TOF MS für die Untersuchung von Glykanen auf monoklonalen Antikörpern. Probenvorbereitungsverfahren und Tipps für MALDI-TOF-MS-Messungen werden angesprochen und die Originaldaten, die von MALDI-Q-IT-TOF MS erhalten wurden, werden vorgestellt.

 Die Glykosylierung ist ein entscheidendes Merkmal für die Entwicklung und Herstellung therapeutischer monoklonaler Antikörper (mAbs) in der Pharmaindustrie. Die konventionelle Antikörper-Glykan-Analyse wird üblicherweise mit der 2-Aminobenzamid (2-AB)-Hydrophilic-Interaction-Liquid-Chromatography-Methode (HILIC) nach der Freisetzung der Glykane durchgeführt. Obwohl diese Methode zufriedenstellende Ergebnisse liefert, ist sie für die Untersuchung einer großen Anzahl von Proben nur begrenzt geeignet, da sie teure Reagenzien erfordert und die Probenvorbereitung mehrere Stunden oder sogar Tage dauert. Eine einfache und schnelle Glykan-Analysemethode war nicht verfügbar. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir

2 ultraschnelle Methoden zur Antikörper-Glykan-Analyse (UMAG) wurden entwickelt und verglichen. Dabei werden Glykopeptide schnell in organischen Lösungsmitteln oder wässrigen Puffern erzeugt und gereinigt, gefolgt von einer markierungsfreien Quantifizierung mittels matrixunterstützter Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie. Beide Methoden liefern schnell N-Glykan-Profile von Testantikörpern, die denen der 2-AB HILIC-HPLC-Methode ähneln. Darüber hinaus hat die UMAG-Methode, die in wässrigem Puffer durchgeführt wird, eine kürzere Testzeit von weniger als 15 Minuten und ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse in 96-Well-PCR-Platten mit minimaler Probenhandhabung. Diese Methode, die schnellste und einfachste, die bisher berichtet wurde, wurde für das Glykoprofiling von mAbs, die unter verschiedenen Zellkulturbedingungen exprimiert wurden, sowie für die Bewertung von Antikörperkulturklonen und verschiedenen Produktionschargen evaluiert. Wichtig ist, dass die Methode Änderungen in Glykoprofilen, die durch herkömmliche 2-AB HILIC-HPLC oder HILIC-UPLC erkannt wurden, empfindlich erfasste. Die Einfachheit, hohe Geschwindigkeit und niedrigen Kosten dieser Methode können die Grundlagenforschung und Prozessentwicklung für neuartige mAbs und Biosimilar-Produkte erleichtern.

(MALDI)-Quelle, eine Quadrupol-Ionenfalle (QIT) und ein Reflectron Time of Flight (reToF)-Massenspektrometer (MS) wurden entwickelt. Es wurden Computersimulationen durchgeführt, um verschiedene Methoden zum effizienten Einführen von MALDI-Ionen in die QIT und zum anschließenden Extrahieren von Ionen aus der QIT in ein zweistufiges gitterloses reToF zu modellieren. Die Parameter für das System wurden optimiert, um eine Einfangeffizienz von nahezu 100 % und die höchste Massenauflösung zu erreichen. Ein Prototyp-Instrument wurde gebaut, um die von den Computersimulationen vorhergesagte Leistung zu erzielen. Es wurden Methoden für die nahezu orthogonale Laserbestrahlung einer Probe, das schnelle Umschalten von Hochfrequenzspannungen (RF) mit großer Amplitude und ein gitterloses zweistufiges Reflektron entwickelt. Diese neuen Entwicklungen wurden mit einer Reihe anderer bereits bekannter Techniken kombiniert, um die Möglichkeit zu schaffen, hocheffizientes Ionenfallen und MS/MS- und höhere (MS ⁿ )-Analysen durchzuführen. Es wurden hohe Massenspektren für m/z bis zu 16.000 erhalten und MS ³  -Experimente erfolgreich durchgeführt. Bei einer Massenauflösung von über 3.000 wurde eine Empfindlichkeit von 0,1 fmol erreicht.

Therapeutische monoklonale Antikörper (mAbs) sind Glykoproteine, die von lebenden Zellsystemen produziert werden. Die an die Proteine ​​gebundenen Glykanreste können die Proteinstabilität, Bioaktivität und Immunogenität direkt beeinflussen. Daher müssen Glykanvarianten eines Glykoproteinprodukts angemessen analysiert und kontrolliert werden, um die Produktqualität sicherzustellen. Die inhärente Komplexität der Proteinglykosylierung stellt jedoch eine gewaltige analytische Herausforderung dar. Dieser Bericht bietet ein Update der jüngsten Fortschritte in der Glykananalyse, einschließlich des potenziellen Nutzens von lektinbasierten Mikroarrays für die Glykanprofilierung mit hohem Durchsatz. Der Schwerpunkt liegt auf dem Vergleich der wichtigsten Analysearten zur Bestimmung einzigartiger Glykanmerkmale wie Glykosylierungsstelle, Glykanstruktur und -gehalt.

Biographie

Sie erhielt 2006 ihren Bachelor-Abschluss in Biochemie an der Fakultät für Naturwissenschaften der Ege-Universität. Derzeit arbeitet sie an ihrer Masterarbeit über „Glycan-Analyse monoklonaler Antikörper“ und wird sie im Sommer 2017 abschließen. Gleichzeitig arbeitet sie seit 2008 als wissenschaftliche Forscherin am Zentrum für Arzneimittelforschung und -entwicklung und pharmakokinetische Anwendungen (ARGEFAR). Ihre Berufserfahrung umfasst die Verwendung von HPLC-, LC-MS- und MALDI-TOF-MS-Techniken. Ihr Forschungsinteresse gilt der physikochemischen Charakterisierung von Biosimilar-Medikamenten und Biopharmazeutika.