Zeitschrift für Proteomik und Bioinformatik
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Abstrakt

Optimierung der Identifizierung citrullinierter Peptide mittels Massenspektrometrie: Ausnutzung der Unfähigkeit von Trypsin, citrullinierte Aminosäuren zu spalten

Di Bennike, Kasper B. Lauridsen, Michael Kruse Olesen, Vibeke Andersen, Svend Birkelund und Allan Stensballe

Citrullinierte Proteine ​​werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, und Citrullinierung kann sehr wahrscheinlich als Ziel für neue Diagnosemittel dienen und Krankheitsätiologien entschlüsseln. Die korrekte Identifizierung citrullinierter Proteine ​​ist daher von größter Bedeutung. Durch Massenspektrometrie (MS) gesteuerte Proteomik kann mit Bottom-up-Strategien Proteinprofile und PTMs in komplexen Proben analysieren. Die ortsspezifische Charakterisierung der Citrullinierung mittels MS bleibt jedoch problematisch, insbesondere bei komplexen Proben, für die keine empfindliche chemische Modifikationstechnik existiert. Eine verpasste tryptische Spaltung nach Citrullin wird daher häufig als Marker für die Nachbearbeitung der Citrullinierung verwendet. Es wurden jedoch auch C-terminale tryptische citrullinierte Peptide beschrieben. In dieser Studie zielten wir daher darauf ab, die Identifizierung citrullinierter Peptide in komplexen Proben zu optimieren. Zur Beurteilung der Spaltungseigenschaften von Trypsin wurde eine Verdauung an synthetischen Peptidsätzen durchgeführt, die entweder Arginin oder Citrullin enthielten. Die Peptidsequenzen stammten von krankheitsassoziierten citrullinierten Proteinen in vivo; Einige davon wurden als C-terminale tryptische citrullinierte Peptide beschrieben. Darüber hinaus wurde die proteolytische Aktivität anhand von verdauten Synovialflüssigkeitsproben eines Patienten mit rheumatoider Arthritis verifiziert. Die Proben wurden mittels Flüssigchromatographie/Tandem-MS mit Elektrospray-Ionisierung analysiert. Unsere In-vivo- und In-vitro-Studien zeigen deutlich, dass Trypsin nicht in der Lage ist, nach Citrullinresten zu spalten. Basierend auf unseren Erkenntnissen präsentieren wir eine Strategie zur Verifizierung citrullinierter Stellen in komplexen Proben nach der Verarbeitung in Proteomik-Shotgun-Experimenten. Indem wir eine verpasste Spaltung zur Identifizierung citrullinierter Peptide verlangen, zeigen wir, dass 64 % der falsch positiv annotierten Citrullinierungsstellen entfernt werden konnten. Darüber hinaus haben wir mögliche Fallstricke bei der Anwendung der Strategie aufgezeigt. Abschließend bleibt die manuelle Annotation von citrullinierten Peptidspektren unerlässlich, um eine korrekte Annotation sicherzustellen. Die Implementierung einer Anforderung für eine verpasste Spaltung reduziert die Anzahl der Spektren, die manuell verifiziert werden müssen, bei minimalem Verlust erheblich. Diese Methode kann zukünftigen Proteomikstudien dabei helfen, citrullinierte Proteine ​​in komplexen Proben zu identifizieren.