ISSN: 2456-3102
Vadim Timerbaev, Sergey Dolgov und Tatyana Mitiouchkina
Trotz der Zunahme der Anzahl genetisch veränderter Pflanzenarten und ihrer offensichtlichen wirtschaftlichen Nützlichkeit werden solche Pflanzen von der Gesellschaft mit Bedacht angenommen, vor allem aufgrund der Präsenz von externem Genmaterial aus fremden Organismen (Mikroben, Viren usw.) zur Bestimmung von Zieleigenschaften in gentechnisch veränderten Pflanzen und als spezifischer Marker der Immunität gegen Toxine und Herbizide. Unter diesen Umständen besteht ein besonderer Bedarf an einem Verfahren, mit dem neue hochwirksame Pflanzenarten ohne externes Genmaterial, im Wesentlichen bakteriellen Ursprungs, und ohne Eigenschaften der Antibiotikaresistenz hergestellt werden können, deren Fehlen höchstwahrscheinlich die Freisetzung genetisch veränderter Organismen in öffentlichen Systemen erleichtern würde, insbesondere in Regionen mit Bedenken im Zusammenhang mit GVO, wie der Europäischen Union.
Da die Methoden zur Gewinnung von markerfreien Organismen erst im letzten Jahrzehnt enorm an Bedeutung gewonnen haben, wird der Großteil der Forschung der Entwicklung neuer Technologien und Vektorsysteme gewidmet. In dieser Arbeit verwendeten wir zur Entfernung der störenden DNA eine ortsspezifische Rekombinase, die zu den pMF-Vektoren gehört (Plant Research International, Wageningen, Niederlande) (Schaart et al., 2004). Der Hauptvorteil dieses Systems ist seine sequentielle Doppelauswahl. Der erste Schritt nach der durch Agrobacterium vermittelten Mutation ist die Identifizierung von Regenerationsmitteln durch Verwendung von Antibiotika wie Kanamycin, Hygromycin oder Phosphinotricin, und die weitere Entfernung von DNA-Gruppen, flankiert von den perfekten Rekombinationsorten (RS), erfolgt aufgrund der chemischen Initiierung der Rekombinase R, die in Sichtweite der Liganden-restriktiven Domäne (LBD) eines Glukokortikoidrezeptors inaktiviert wird. Seine Aktivierung wird nach dem Brüten des Pflanzengewebes in einer Dexamethason-Lösung (Dex) abgeschlossen. Die weitere Auswahl auf einem Medium mit 5-Fluorocytosin (5-FC) verhindert die Entwicklung von Pflanzengeweben, die das codA-Gen enthalten (Cytosin-Deaminase wandelt ungiftiges 5-FC in zytotoxisches 5-Fluorouracil um).
Das Vorhandensein von Markereigenschaften, insbesondere antibakterieller Resistenz, in genetisch veränderten Pflanzen ist aufgrund von Befürchtungen im Zusammenhang mit Risiken für die Umwelt und die menschliche Gesundheit in der Öffentlichkeit besorgniserregend. Die Entwicklung gentechnisch veränderter Pflanzen, die kein externes genetisches Material, insbesondere Bakterien- und Viruswurzeln, enthalten, verringert die Belastung erheblich. Hier verwendeten wir das pMF-System, das aus der Z. rouxii-Rekombinase R und einem bifunktionellen CodA-nptII-selektierbaren Molekül besteht, um markerlose transgene Tomaten- und Apfelpflanzen zu erzeugen, die das sehr süße ThaumatinII-Molekül der tropischen Pflanze Thaumatococcus daniellii enthalten, das aus dem Molekül E8 des nährstoffspezifischen Werbetreibenden und dem rbsS3A-Eliminator besteht. Wir verwendeten zwei verschiedene Rekombinase-Registrierungen.
Frühe Auswahl wichtiger Callus und verzögerte Decsametason-Behandlung von Blättern oder Blattstielen transgener Pflanzen mit weiterer Auswahl auf 5-FC-Medium. Als Alternative haben wir Pflanzen durch Vektoren verändert, die nur Thaumatin-Artikulationsband ohne spezifische Marker enthielten. Transgene für diesen Fall wurden durch PCR-Analyse aller erhaltenen Regeneranten ausgewählt. Wir haben 170 transgene Tomatenlinien erhalten, die vollständig durch PCR zerlegt wurden. Nach Akzeptanz der Rekombinase-Bewegung wurde nur eine völlig markerfreie transgene Tomatenlinie erhalten. Die vergleichbaren Ergebnisse wurden durch frühe Bestimmung erhalten. Direkte Veränderung durch Thaumatin-II-Band führte ebenfalls zu zwei markerfreien Pflanzen. Wir schlagen vor, dass eine fragmentierte Extraktion und chromosomale Revisionen aufgrund der Nähe verschiedener und atypischer oder unvollständiger T-DNA-Einschlüsse in verschiedenen Fällen einfach veränderter Tomatenpflanzen stattfinden.
Wir haben außerdem drei freie transgene Apfellinien erhalten, die durch PCR vollständig auf das Vorhandensein von T-DNA-Sequenzen analysiert wurden. Wir verwendeten dann die verzögerte Methode zur Auswahl markerfreier Pflanzen, wobei eine getestete Linie alle Abschnitte des Expressionsbandes enthielt. Nach der Akzeptanz der Rekombinaseaktivität haben wir über 30 Sublinien erhalten, von denen die meisten ihre Kanamycin-Resistenz verloren haben. PCR und Southern-Spray-Analyse ergaben, dass alle ungünstigen Merkmale und Kombinationen zwischen RS-Zielen durch den Rekombinationsprozess eliminiert wurden, während die Expression von Merkmalen der Interferenz mit regulatorischen Elementen in vollständig entwickelten Pflanzen vorhanden ist. Durch Semi-Quanten-PCR-Analyse können wir jedoch die Expression von Thaumatin-Merkmalen in den meisten, aber nicht allen entstandenen Sublinien identifizieren. Das frühe Identifizierungsverfahren als sofortige Veränderung war für die Produktion markerfreier Apfelpflanzen unwirksam. Das pMF-System ist für die Produktion markerfreier Äpfel oder anderer hartnäckiger Pflanzen geeignet, da cisgene Tomatenpflanzen durch direkte Veränderung durch die Expression von Merkmalen der Interferenz gewonnen werden können. Die Untersuchung wurde teilweise durch einen Forschungspreis Nr. 14-50-00079 der Russischen Wissenschaftsstiftung gefördert.