Zeitschrift für Chromatographie und Trenntechniken
Offener Zugang
ISSN: 2157-7064
ISSN: 2157-7064
Mastrobuoni G, Zasada C, Bindel F, Aeberhard L und Kempa S
Das Zusammenspiel zwischen Auflösung, Genauigkeit, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit des Massenspektrometers sowie die Komplexität des Peptidgemischs in Bezug auf die chromatographische Trennung und die Analysezeit bestimmen letztendlich die Anzahl der identifizierten Proteine in einer „Shotgun“-Proteomstudie. Die Verbesserung eines dieser Parameter kann die Qualität der Proteomanalyse verbessern. Hier haben wir die Technik der isoelektrischen Fokussierung (IEF) in Lösung zur Vorfraktionierung tryptischer Peptide vor der LC-MS/MS-basierten Proteomanalyse evaluiert. Die IEF in Lösung erwies sich als einfache und schnelle Methode zur Peptidfraktionierung vor der LC-MS-Analyse. Durch Anpassung der experimentellen Verfahren ermöglichte dieser Ansatz die Identifizierung von mehr als 44.000 Peptiden, die zu 5.800 Proteinen gehören, in weniger als 48 Arbeitsstunden, von der Proteinextraktion bis zum Ende der LC-MS-Analyse. Diese Technik wurde erfolgreich angewendet, um die Proteome von Säugetierzellen und verschiedenen Modellorganismen ohne zusätzlichen Aufwand oder spezielle technische Ausrüstung zu analysieren. Die In-Solution-IEF von Peptiden ist sehr robust und kann in Kombination mit verschiedenen Extraktionsverfahren angewendet werden. Die hohe Anzahl identifizierter Peptide unter Verwendung eines Standard-LC-MS-Systems führte zu einer durchschnittlichen Proteinabdeckung von 25 %. Eine so hohe durchschnittliche Anzahl identifizierter Peptide pro Protein verbesserte die Unterscheidung von Proteinarten als Isoformen oder Spleißvarianten. Somit ist die In-Solution-IEF eine schnelle und robuste Alternative zur gelbasierten Proteomik oder anderen gelfreien Fraktionierungstechniken vor der LC-MS/MS-Analyse. Die Verkürzung der Verarbeitungszeit und die hohe Leistung dieser Technik können tiefgehende Proteomikanalysen erheblich beschleunigen.