Zeitschrift für Thermodynamik und Katalyse
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Abstrakt

Reduzierte Hydrophobie der Minor Groove Intercalation Loop ist entscheidend für effiziente Katalyse durch kälteadaptierte Uracil-DNA-N-Glycosylase aus Kabeljau

Elin Moe, Netsanet Gizaw Assefa, Ingar Leiros, Kathrin Torseth, Arne O Smalås und Nils Peder Willassen

Die kleine Furchen-Interkalationsschleife (Leucinschleife) in Uracil-DNA-N-Glycosylasen (UNGs) erfährt bei Substratinteraktion signifikante Konformationsänderungen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die an Kälte angepasste UNG des atlantischen Kabeljaus (cUNG) eine zehnfach höhere katalytische Effizienz besitzt als die menschliche UNG (hUNG). Ein Sequenzvergleich der beiden Enzyme ergab Aminosäuresubstitutionen in und nahe der Leucinschleife von cUNG, die die Elastizität der Schleife erhöhen und so die beobachtete höhere katalytische Effizienz von cUNG im Vergleich zu hUNG erklären könnten. Um diese Hypothese zu untersuchen, haben wir fünf einfache und vier multiple Mutanten von cUNG mit Substitutionen von Kabeljau zu menschlicher UNG konstruiert und sie durch kinetische Experimente bei drei verschiedenen Temperaturen (15, 22 und 37°C) und Differential Scanning Calorimetry (DSC) charakterisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Mutationen den kcat stärker beeinflussten als den KM, und Mutanten mit offensichtlich verringerten hydrophoben Eigenschaften (A266T, V267A, A266T/V267A und A266T/ V267A/A274V) zeigten einen erhöhten oder gleichwertigen kcat-Wert wie cUNG, während Mutanten mit vorhergesagt erhöhter Hydrophobie (A274V, H275Y, L279F, A266T/V267A/A274V/H275Y und A266T/V267A/A274V/H275Y/H250Q) einen verringerten kcat-Wert im Vergleich zu cUNG zeigten. Somit verringert die Nachahmung der Aminosäurezusammensetzung der Leucinschleife in hUNG die Aktivität von cUNG. Die DSC-Experimente wurden durchgeführt, um eine mögliche Erhöhung der Gesamtstabilität der Mutanten infolge der veränderten Hydrophobie der Leucinschleife zu ermitteln. Die Ergebnisse zeigten jedoch eine leichte Verringerung der Gesamtstabilität bei Mutanten mit erhöhtem kcat und eine erhöhte Stabilität bei Mutanten mit reduziertem kcat. Wir vermuten, dass diese Ergebnisse auf die Notwendigkeit zurückzuführen sind, eine potenziell erhöhte/reduzierte Elastizität der Leucinschleife auszugleichen, die durch die Aminosäuresubstitutionen eingeführt wird. Diese Studie bestätigt die vermutete Bedeutung der Leucinschleife für die effiziente Katalyse von UNG und zeigt, dass es möglich ist, die katalytische Kapazität dieses Enzyms durch Manipulation der Aminosäurezusammensetzung dieser Schleife zu verändern.