Fortgeschrittene Techniken in Biologie und Medizin
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Abstrakt

Screening von Mutationen/SNPs durch spektrophotometrische Schmelzkurvenanalyse: Eine vorläufige Studie zur nicht-elektrophoretischen und farbstofffreien Methode zur Mutationserkennung

Arif Ahmad*, Mohammad Shahid, Mohammad Raish und Syed Akhtar Husain

Derzeit verfügbare Methoden zum Screening auf Mutationen erfordern fluoreszierend markierte Sonden/Farbstoffe oder Elektrophorese oder beides, was diese Methoden mühsam, teuer und zeitaufwändig macht. Hier beschreiben wir eine Methode zum Screening auf Mutationen/SNP ohne Sonde/Farbstoff und Elektrophorese. Die Technik erfordert lediglich ein PCR-Produkt und ein Spektralphotometer mit Peltier-Element. Wir screenten auf Mutationen, indem wir das DNA-Schmelzprofil und die Übergangstemperatur von Homoduplex und Heteroduplex überwachten, indem wir die UV-Absorption durch Schmelzen des Duplex aufzeichneten. Die Absorption für jeden Duplex wurde bei 260 nm von 60°C bis 85°C in Temperaturschritten von 1°C gemessen, wobei ein Spektralphotometer mit Peltier-Element und einer Heizrate von 1°C/min verwendet wurde. In den Heteroduplexproben steigt die UV-Absorption bei Übergangstemperaturen von 70°C schnell an, während sie in der Homoduplexprobe nach 75°C erreicht wird. Die Mutation in der Probe wurde durch Beobachtung der Abnahme der Übergangstemperatur der Heteroduplexproben im Vergleich zu den Homoduplexproben festgestellt.