Zeitschrift für klinische und experimentelle Ophthalmologie
Offener Zugang

Abstrakt

Suche nach alternativ gespleißten Varianten von Phospholipase Domain-Containing 2 (Pnpla2), einem neuen Gen in der Netzhaut

Jacqueline Talea DesJardin, S Patricia Becerra und Preeti Subramanian

Zweck: Ensembl und andere EST-Datenbanken (Expressed Sequence Tag) zeigen mutmaßliche alternative Spleißvarianten bei Mäusen und Ratten für Pnpla2 , das Gen, das den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor-Rezeptor (PEDF-R) kodiert. Der Zweck dieser Studie war es, experimentelle Beweise für Pnpla2- Spleißvarianten bei Mäusen zu erhalten .

Materialien und Methoden: Es wurden Kulturen einer Mauszelllinie verwendet, die aus Photorezeptoren (661W-Zellen) und Mäuseaugen-, Herz-, Fett-, Nieren- und Lebergewebe gewonnen wurde. Aus Zellen und Geweben wurde Messenger-RNA (mRNA) isoliert und komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert. Primerpaare für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden so entwickelt, dass sie die mutmaßlichen Spleißstellen flankieren. Eine Exon-Ausschluss-Echtzeit-PCR wurde verwendet, um die Amplifikation des vollständigen Pnpla2- Transkripts zu reduzieren und die Amplifikation von Spleißvarianten mit geringer Häufigkeit zu verstärken. PCR-Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mit einem UV-Transilluminator nachgewiesen. Rekombinante Plasmide, die eine menschliche PNPLA2 -cDNA in voller Länge oder eine PNPLA2 -cDNA ohne Exon 5b (E5b) enthielten, dienten als Kontrollen zur Validierung der Techniken. Es wurden Gesamtzelllysate aus 661W-Zellen hergestellt. Der Nachweis des PEDF-R-Proteins erfolgte mittels Western Blots.

Ergebnisse: PCR-Produkte für Pnpla2 -Transkripte, die aus 661W-Zellen oder verschiedenen Mausgeweben gewonnen wurden, lösten sich nach Amplifikation mit mehreren Primerpaaren in ein einziges Band auf. Die gleichzeitige Amplifikation von zwei PNPLA2-cDNAs in verschiedenen Molarverhältnissen verhinderte die Erkennung von Transkripten mit geringerer Häufigkeit. Selbst wenn die cDNA für das vollständige Pnpla2- Transkript mithilfe der Exon-Ausschlussmethode signifikant ausgeschlossen wurde, waren jedoch keine Bänder nachweisbar, die Pnpla2- Spleißvarianten entsprachen. Dennoch zeigten Western Blots von gesamten 661W-Zelllysaten mit zwei verschiedenen Antikörpern Isoformen für das PEDF-R-Protein.

Schlussfolgerungen: Die Daten liefern Beweise für die Existenz eines einzelnen Pnpla2- Transkripts in voller Länge, das zu einem einzelnen Proteinprodukt führen könnte, das eine posttranslationale Verarbeitung durchläuft.