Zeitschrift für klinische und experimentelle Ophthalmologie
Offener Zugang

Abstrakt

Standardisierung der Isolierung menschlicher Hornhautendothelzellen und Verwendung freigelegter menschlicher Amnionmembranen als Gerüst für menschliche Hornhautendothelzellen

Kalpana Suresh, Alan Mathew Punnoose, Sarah Kuruvilla und Tanvi Khanna

Ziele: Standardisierung der Isolierung menschlicher Hornhautendothelzellen (HCECs) und Verwendung der freigelegten menschlichen Amnionmembran (HAM) als Gerüst für isolierte HCECs.
Methoden: Die menschliche Amnionmembran wurde 60 Minuten lang bei 37 °C mit 1,2 Einheiten/ml Dispase II freigelegt, gefolgt von mechanischem Abschaben. Hornhautendothel- und Descemet-Membranschichten wurden von den für chirurgische Eingriffe ungeeigneten Augen menschlicher Spenderkadaver abgezogen und 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 enzymatisch mit 2 mg/ml Collagenase-II-Lösung verdaut. Isolierte Zellen wurden in Kulturmedium mit Ergänzungen resuspendiert und vier Stunden lang auf unbeschichtetes Kulturgefäß plattiert, um Fibroblasten zu eliminieren, die schneller anhaften als Endothelzellen. Nach dem Vorplattieren wurden die nicht anhaftenden Zellen auf mit Gelatine beschichtete Schalen oder auf freigelegte Amnionmembran in OptiMEM-Medium, ergänzt mit Wachstumsfaktoren, ausgesät. Die Zellen wurden mikroskopisch auf Anhaftung und polygonale Morphologie untersucht.
Ergebnisse: Die Mikroskopie der freigelegten Amnionmembran zeigte keine Epithelzellreste. Die enzymatische Verdauung der Hornhaut hinterließ azelluläre Descemet-Schichten, wobei die Endothelzellen einzeln oder in Clustern schwammen, wobei die Vorplattierung zu einer Isolierung von Endothelzellen ohne Fibroblasten beitrug. Nur wenige isolierte Zellen konnten sich auf der Amnionmembran festsetzen und diese Anhaftung bei nachfolgenden Medienwechseln beibehalten.
Schlussfolgerung: Eine längere Behandlung von HAM mit dem milden Enzym Dispase-II führt zur Freilegung der Membran, die als erfolgreiches Gerüst für entnommene Hornhaut-Endothelzellen dient. Dieser Ansatz kann als kostengünstige Alternative zur Endothelzellproliferation und als In-vitro-Modell für Studien zur Hornhautgewebezüchtung weiter untersucht werden.