Fortgeschrittene Techniken in Biologie und Medizin
Offener Zugang
ISSN: 2379-1764
ISSN: 2379-1764
Kozo Hayashi und Hiroyuki Kobayashi
Der β1-adrenerge Rezeptor (Adrb1), ein Mitglied der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR)-Superfamilie, ist ein wichtiger Regulator der Herzfunktion. Alle GPCRs sind an mehreren Stellen phosphoryliert und das spezifische Phosphorylierungsmuster fungiert als „Barcode“ zur gewebespezifischen Regulierung der Rezeptorfunktion und nachgelagerter physiologischer Prozesse. Aufgrund fehlender spezifischer Antikörper ist jedoch wenig über den Ort und die Funktion der Adrb1-Phosphorylierungsstellen in vivo bekannt. Als ersten Schritt zur Ermittlung der Phosphorylierungszustände von Adrb1 und der damit verbundenen Funktionen im Mäuseherzen in vivo haben wir die folgende experimentelle Strategie entwickelt: 1) Identifizierung agonistenabhängiger Adrb1-Phosphorylierungsstellen im isolierten perfundierten Mäuseherzen mittels fortschrittlicher Phosphoproteomik-Techniken; 2) endgültige Zuordnung dieser Phosphorylierungsstellen durch hochwertige Massenspektrometrie (MS)-Daten, die von Adrb1-überexprimierenden HEK 293T-Zellen gewonnen wurden; 3) Erzeugung von Knock-in-Mäusen (KI), die Adrb1 exprimieren, das mit einem FLAG-Tag am N-Terminus fusioniert ist, zur Immunaffinitätsreinigung, um den Phosphorylierungsstatus im lebenden Organismus aufzudecken; 4) Aufklärung der Phosphorylierungsniveaus an bestimmten Stellen von Adrb1 im KI-Mausherzen durch MS-Messungen des Intensitätsverhältnisses zwischen phosphoryliertem Peptid und entsprechenden unphosphorylierten Peptidionen. Mit dieser Strategie identifizierten wir Ser462 am C-Terminus von Adrb1 als agonistenabhängige Phosphorylierungsstelle im perfundierten Mäuseherzen. Wir enthüllten auch die basalen Phosphorylierungsverhältnisse bei Ser274 (0,25), Ser417 (0,55) und Ser462 (0,0023) in KI-Mäusen. Diese Erkenntnisse liefern neue Einblicke in die Regulationsmechanismen der Adrb1-Funktion, die durch ortsspezifische Phosphorylierung vermittelt werden.