Journal of Glycomics & Lipidomics
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Abstrakt

Synthese von markiertem Rifabutin-Dithiocarbamat: Ein potenzielles bildgebendes Mittel gegen Mycobacterium Tuberculosis

Syed Qaiser Shah

Bei dieser Untersuchung wurde Rifabutin-Dithiocarbamat (RFND) unter Verwendung der Tricarbonyltechnik mit Technetium-99m (99mTc) markiert. Das markierte RFND wurde ferner hinsichtlich seiner radiochemischen Reinheit, Stabilität in Kochsalzlösung und Serum, bakterieller Bindung in vitro, Bioverteilung im Tiermodell Ratten und szintigraphischer Genauigkeit im Tiermodell Kaninchen charakterisiert. Abschließend wurden verschiedene radiobiologische Eigenschaften des 99mTc(CO)3-RFND mit dem kürzlich gemeldeten 99mTc-RFN verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass die Dithiocarbamatform von RFN eine bessere radiochemische Reinheit, Stabilität in Kochsalzlösung, bakterielle Bindung, Bioverteilung und gezieltere Bildgebung zeigte als das kürzlich gemeldete 99mTc-RFN. Diese besseren radiobiologischen Parameter machten 99mTc(CO)3-RFND zu einem zuverlässigeren Mittel für die Tuberkulosebildgebung. Eine der größten Errungenschaften der Wissenschaftler des letzten Jahrhunderts war die Entwicklung von Impfstoffen und Antibiotika, mit denen die Mehrheit der Infektionskrankheiten weitgehend eliminiert oder in den Griff bekommen wurden. Trotz dieser enormen Erfolge bei der Diagnose und Behandlung von Infektionskrankheiten stehen Infektionen nach wie vor im Fokus der Forschung und gelten auch heute noch als Hauptursache für Morbidität und Mortalität. Dank der Fortschritte in der klinischen Pathologie können Infektionskrankheiten durch einfache Labortests erkannt und erfolgreich mit geeigneten Medikamenten behandelt werden. Es ist jedoch zu beobachten, dass ein Großteil dieser Infektionen, die zum Tod führen, auf Erkrankungen zurückzuführen sein könnte, die im Frühstadium schwer zu erkennen sind. Eine frühzeitige und rechtzeitige Erkennung in solchen Situationen könnte zu einer angemessenen Behandlung beitragen und so die Sterbewahrscheinlichkeit verringern. Die Nuklearmedizinische Szintigraphie (NMST) bietet aufgrund ihrer höheren Empfindlichkeit eine andere Alternative zur Lokalisierung einer vermuteten bakteriellen Infektion. Im Falle einer tiefen Gewebeinfektion, einer Knocheninfektion, akuter lebensbedrohlicher Infektionen, die eine frühzeitige angemessene Behandlung erfordern, z. B. Blinddarmentzündung, schwerer chronischer Infektionen aufgrund von Arzneimittelresistenz und opportunistischer Infektionen bei immungeschwächten Personen kann die NMST von Nutzen sein. Fragen wie das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer Infektion sowie deren Ort, Schwere und mögliche Ursache können mithilfe der NMST beantwortet werden. Um diese Fragen jedoch genau beantworten zu können, ist ein zuverlässiges Radiomedikament erforderlich, das sich am Infektionsort anreichern kann. Das für die Szintigraphie vorgesehene Radiomedikament muss die oben genannten Fragen beantworten, darf jedoch nicht toxisch sein, muss in den Zielgebieten besser aufgenommen werden, darf niedrig dosiert sein und muss kostengünstig und leicht erhältlich sein.  Die gemeldeten Wirkstoffe und ihre Derivate haben in ihren sehr frühen Stadien vielversprechende spezifische Ziel- (Infektionsbereich) zu Nicht-Ziel- (nicht infektiöse Bereiche) Verhältnisse gezeigt, neben einem normalen Kreislauf- und Ausscheidungsverhalten. Allerdings ist das Auftreten von multiresistenten Bakterien wie  Mycobacterium tuberculosis  (MBT) stellt für Kliniker eine ernste Bedrohung dar, wenn sie derartige Infektionen frühzeitig erkennen und behandeln müssen. In diesem Schema wurde die Markierung von Rifabutin-Dithiocarbamat (RFND) mit  ^99m Tc unter Verwendung der Tricarbonyltechnik untersucht. Die Durchführbarkeit des Tricarbonyl-Markierungsverfahrens beruht auf dem schlecht gebundenen H2O _des 99m  ^Tc (OH2 ₎ 3 ₍ CO) ₃ ] ⁺  -Vorläufers, der leicht ersetzt werden kann. Das markierte RFND wurde außerdem hinsichtlich seiner radiochemischen Reinheit, Stabilität in Kochsalzlösung und Serum,  bakterieller Bindung in vitro  , Bioverteilung in Tiermodellratten und szintigraphischer Genauigkeit in Tiermodellkaninchen charakterisiert. Schließlich wurden verschiedene radiobiologische Eigenschaften des  ^99m Tc(CO) _{3 -RFND mit dem kürzlich gemeldeten} ^99m Tc-RFN verglichen  . Rifabutin (RFN) wurde von Chengdu Yuyang High-Tech Developing Co., Ltd. China und alle Chemikalien und Lösungsmittel von Sigma bezogen. In dieser Arbeit wurden HPLC von Shimadzu, Well Counter von Ludlum, Dosiskalibrator von Capintech und eine Gammakamera von Nuclearmedizine verwendet. Rifabutin (RFN) wurde unter Anwendung der früher beschriebenen Methode ²⁸ zu Rifabutin-Dithiocarbamat (RFND) derivatisiert . Kurz gesagt wurden 0,002 mol RFND und 2,4 mg NaOH in einem sauberen, sterilisierten Fläschchen gemischt. Danach wurden 22 ml Tetrahydrofuran (THF) in das Reaktionsfläschchen gegeben und 30 min in einem Eisbad geschüttelt. Dann wurden 2 ml Kohlenstoffdisulfid (CS2 ₎ zugegeben und das Reaktionsfläschchen 8 h in einem Eisbad unter ständigem Schütteln stehen gelassen. Danach wurde die Mischung unter ständigem Rühren bis zu 12 h bei Raumtemperatur verarbeitet und anschließend durch Rekristallisation wiederhergestellt. Das RFND wurde mittels modernster spektroskopischer Techniken charakterisiert. Synthese von 99mTc(CO)3-RFND und radiochemische Reinheit Natriumpertechnetat 1 mCi (0,2 ml) wurde mit 2 mg (gelöst in 0,4 ml normaler Kochsalzlösung) RFND gemischt, gefolgt von einer pH-Anpassung (pH 10) mit 0,1 mol/l HCL in einem mit sauberem Stickstoffgas gefüllten sterilisierten Fläschchen. Danach wurde die Mischung in ein Isolink-Kit überführt, gefolgt von einer Inkubation zur optimalen Markierung bei 25 °C für 15 Minuten. Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) wurde verwendet, um  ^99m Tc(CO) ₃ -RFND hinsichtlich der radiochemischen Reinheit mit der zuvor beschriebenen Methode zu charakterisieren. Kurz gesagt, 10 µL  ^99m Tc(CO) ₃-RFND wurde dem HPLC-System zugeführt, das mit einem bei 254 betriebenen UV-Detektor, einem Durchfluss-Szintillationszähler, einer C-18-Säule und einer binären Pumpe ausgestattet war. Danach wurde die Säule 15 Minuten lang bei einer Durchflussrate von 1 ml/min mit Wasser und Methanol (W:M) eluiert. Das austretende Material wurde in getrennten Fläschchen gesammelt und anschließend auf Aktivität gezählt. Aufnahme durch Mycobacterium Tuberculosis (MBT) Die MBT-Aufnahme von  ^99m Tc(CO) ₃ -RFND wurde unter Anwendung der zuvor beschriebenen Methode bewertet. Kurz gesagt wurden 0,8 ml Essigsäure (0,01 M), die ungefähr 1 x 10 ⁸  koloniebildende Einheiten (CFU) MBT enthielt, und 0,2 ml Natriumphosphatpuffer 60 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert und nach dem Entfernen des Überstands nach Suspendieren in 1,5 ml Natriumphosphatpuffer erneut zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand erneut entfernt und die Bakterienpellets auf Aktivität gezählt. Die prozentuale  In-vivo-  Aufnahme von  ^99m Tc(CO) ₃ -RFND wurde an gesunden und künstlich infizierten Tiermodellratten ermittelt. Die Tiere wurden in zwei Gruppen, nämlich A und B, aufgeteilt. Den Tieren der Gruppe A wurden etwa 1 x 10 ⁸ koloniebildende Einheiten (CFU) in 0,2 ml MBT-Kochsalzlösung intramuskulär in das linke Bein der anästhesierten Sprague-Dawley-Ratte (Gewichtsbereich 200–250 g) injiziert, um eine Infektion hervorzurufen. Nach acht Stunden wurde derselben Ratte zur Herbeiführung einer Entzündung eine äquimolare Menge steriles Öl in das rechte Bein injiziert, gefolgt von einer intravenösen Verabreichung von 0,5 mCi  ^99m Tc(CO) ₃ -RFND. Bei Tieren der Gruppe B wurde der obige Prozess ohne Verabreichung von MBT wiederholt. Danach wurden die Ratten in unterschiedlichen Abständen nach intravenöser Injektion des Radiomedikaments gemäß den Verfahren der pakistanischen Atomaufsichtsbehörde (PNRA), des Ethikkomitees und der pakistanischen Atomenergiekommission (PAEC) getötet. Danach wurde die prozentuale  In-vivo -  Aufnahme von  ^99m Tc(CO) ₃ -RFND in einem Gramm Blut, Milz, Magen, Darm, Niere, infiziertem, entzündetem und normalem Muskel unter Verwendung eines Gammazählers gemessen. Bildgebung mit 99mTc(CO)3-RFND Gesunde Kaninchen (Gewicht: 3,0 bis 4,0 kg) wurden zur Beurteilung des Bildgebungsprofils des vorliegenden Radiomedikaments verwendet. 0,5 ml MBT mit 1 x 10 ⁸ KBE wurden in das linke Bein des gesunden Kaninchens injiziert und nach 8 Stunden wurden in das rechte Bein desselben Kaninchens 0,5 ml steriles Öl injiziert. Schließlich wurde das Kaninchen mit dem Gesicht nach oben auf die Liegefläche der Gammakamera gelegt, gefolgt von einer intravenösen Injektion von 2 mCi  ^99m Tc(CO) ₃ -RFND. Ganzkörperbilder wurden in verschiedenen Intervallen mit einem Low Energy General Purpose (LEGP)-Kollimator aufgenommen.