Zeitschrift für pharmazeutische Pflege und Gesundheitssysteme
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Abstrakt

Das Verfahren zur Herstellung von Noisomen-Nanopartikeln durch mikrofluidisches Mischen für die siRNA-Abgabe

Mohammad A. Obeid

Bei der RNA-Interferenz wird eine Ziel-Messenger-RNA durch den Einbau kurzer interferierender RNAs (siRNA) abgebaut [1]. RNA-Interferenz (RNAi), das beliebteste biologische Werkzeug, bei dem doppelsträngige RNA (dsRNA) Gen-Silencing auslöst, indem sie komplementäre mRNA zum Abbau anvisiert, ist eine enorme Innovation in der universellen therapeutischen Behandlung von Krankheiten und verändert die Art und Weise, wie Wissenschaftler die Funktion von Genen untersuchen. siRNAs erweitern das Wissen über die submolekularen Komponenten der endogenen RNA-Impedanz und entwickeln sich zu innovativen Nukleinsäuremedikamenten zur Behandlung tödlicher Krankheiten wie Krebs.

Kleine interferierende RNAs (siRNAs) sind fälschlicherweise zusammengesetzte, 19–23 Nukleotide lange, doppelt isolierte RNA-Moleküle. Sie werden in der Physik routinemäßig zur vorübergehenden Unterdrückung von Reizqualitäten eingesetzt. Sie induzieren RNAi-Reaktionen, nachdem sie auf ihr Zieltranskript übertragen wurden, basierend auf der Sequenzkomplementarität. Sie wurden erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen verschiedener onkogener lncRNAs auf den Funktionsverlust zu untersuchen.

Die siRNA hat neue Möglichkeiten für die Entwicklung innovativer Medikamente zur Behandlung bereits bestehender schwerer Krankheiten wie Krebs eröffnet. Sie ist von natürlicher Wirksamkeit, da sie den endogenen RNAi-Pfad missbraucht, eine gezielte Reduzierung krankheitsbedingter Merkmale ermöglicht und für jedes Merkmal mit einem entsprechenden Ansatz geeignet ist. Als Grundlage für die siRNA-gestützte Merkmalsbehandlung bietet die genetische Natur der Krankheit eine starke Unterstützung. Tatsächlich wurden mehrere siRNAs entwickelt, um dominante Onkogene, mit der Karzinogenese verbundene virale Onkogene oder fehlgeleitete Onkogene anzugreifen.

Mechanismus:

Der erste Schritt der RNAi umfasst die Verarbeitung und Spaltung längerer doppelt isolierter RNA in siRNAs, die normalerweise einen 2-Nukleotid-Überhang am 3'-Ende jedes Strangs aufweisen. Das für diese Verarbeitung verantwortliche Protein ist ein RNase III-ähnlicher Rezeptor namens Dicer. Nach der Bildung werden siRNAs durch einen Multiprotein-Fragmentkomplex isoliert, der als RISC (RNAinduced hushing complex) bezeichnet wird. Innerhalb des RISC-Komplexes werden siRNA-Stränge getrennt und der Strang mit dem stabileren 5'-Ende wird normalerweise in den aktiven RISC-Komplex integriert. Das Antisense-Fragment einer einfach isolierten siRNA steuert und reguliert dann den RISC-Komplex auf der Ziel-mRNA und durch die Aktivität des synergistischen RISC-Proteins, einem Mitglied der Argonauten-Familie (Ago2), wird mRNA abgetrennt.

Methoden:

NISV wurden durch mikrofluidisches Mischen hergestellt, eine kürzlich entwickelte Technik zur Herstellung von Nanopartikeln auf Lipidbasis, die zur Bildung kleiner Vesikel mit wirksamer Darstellung eines medizinischen Wirkstoffs führt. Zur Herstellung von NISV wurden bestimmte Volumina aus jeder Stammlösung der NISV-Komponenten gemischt, um die Lipidphase herzustellen. Die Lipidphase wurde in die erste Bucht und die flüssige Phase in die zweite Bucht des mikrofluidischen Mikromischers infundiert, wobei die Mischtemperatur auf 50 °C eingestellt wurde. Das Durchflussverhältnis (FRR) zwischen der flüssigen und der organischen Phase wurde auf 3:1 eingestellt und die Gesamtdurchflussrate (TFR) der beiden Phasen auf 12 ml/min. Dies ermöglicht eine schnelle Mischung zwischen den beiden Phasen bei hohen Durchflussraten und einer Temperatur über dem Phasenverlauf der Lipide. Anschließend wurden Streuungen aus dem Abflussstrom gesammelt und schnell verdünnt, um den endgültigen Ethanolgehalt in der Lösung auf 6,25 % (v/v) zu senken. Die Zytotoxizitätsbewertung von NISV wurde an Nicht-Kleinlungenkrebszellen (A549) und Maus-Melanomzellen (B16-F10-LUC) durchgeführt. siRNA, die auf grünes fluoreszierendes Protein (GFP) in copGFP-A549-Zellen oder Luciferase in B16-F10-LUC-Zellen abzielt, wurde in NISV typisiert. Die Hemmung der GFP-Expression durch gegen GFP siRNA (siGFP), die unter Verwendung von NISV übertragen wurde, wurde mittels Durchflusszytometrie, Polymerase-Kettenreaktion und Western-Rubbel bewertet. Nackte BALB/c-Mäuse, die mit B16-F10-LUC-Zellen geimpft wurden, die Melanom-sprechende Luciferase auslösen, wurden verwendet, um die Fähigkeit von NISV, siRNA in vivo zu übertragen, zu untersuchen.

Ergebnisse:

Zytotoxizitätsstudien zeigten, dass NISV bei oder unter 40 µg/ml nicht schädlich waren. NISV-Definitionen hatten eine hohe siRNA-Exemplifikationseffizienz. Fluoreszenzlupen- und Durchflusszytometriestudien zeigten eine hohe Zellaufnahme durch die Zellen im Vergleich zu nackter siRNA, die nicht von den Zellen aufgenommen wurde. NISV war in der Lage, siGFP an die Zellen zu übertragen und die GFP-Expression vollständig zu unterdrücken. Diese Ergebnisse wurden durch Transfektion der Luciferase produzierenden B16-F10-LUC-Zellen mit anti-Luciferase-siRNA (siLUC) bestätigt. Die Messung des Grads der Luciferase-Expression nach siLUC-Transfektionen unter Verwendung eines Luciferase-Proteinmesssystems zeigte erfolgreich die Verdeckung der Luciferase-Expression. NISV wurden dann in In-vivo-Tests mit nackten BALB/c-Mäusen eingesetzt. Nach intratumoraler Infusion wurde siLUC an die Zellen übertragen und unterdrückte die Luciferase-Aussprache auf einem wesentlich höheren Niveau als bei Mäusen, die mit freiliegendem siLUC belohnt wurden. Diese In-vivo-Ergebnisse bestätigen die Fähigkeit von NISV, siRNA effektiv in das Zytoplasma der Zielzellen zu übertragen und das Zielprotein zu unterdrücken.

Abschluss:

NISV wurde bereits umfassend nachgewiesen und kann als Transportsystem für siRNA verwendet werden. Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass NISV eingesetzt werden kann, um die Hindernisse bei siRNA-basierten Therapeutika zu überwinden, beispielsweise geringe Stabilität und schlechte Zellaufnahme.