ISSN: 2169-0111
Pouiré Yaméogo
Die meisten Fälle von Friedrich-Ataxie werden durch die Einfügung einer GAA-Wiederholungssequenz (GAAr) in das erste Intron des Frataxin-Gens verursacht, was zu einer Verringerung der Proteinexpression führt. Die Löschung dieses GAAr durch die CRISPR-Cas9-Technologie führt zu einer Erhöhung der Frataxin-Expression. Aufgrund der begrenzten Größe der AAV-Verpackung erforderte die Entfernung des GAAr durch SpCas9 zwei Adeno-assoziierte Viren (AAVs). Die Verwendung von 2 AAVs verringert die Effizienz einer möglichen Behandlung, da jede Zelle von beiden Viren infiziert werden muss. Wir haben daher CjCas9 verwendet, da es klein genug ist, um mit zwei sgRNAs von einem einzigen AAV übertragen zu werden. Eine konstitutive Expression des CjCas9-Gens, die durch ein AAV in vivo übertragen wird, kann jedoch Off-Target-Mutationen erhöhen und eine Immunantwort gegen das Cas9-Protein auslösen. Die zeitliche Expression ist für das CRISPR-System wichtig. Wir haben zwei Ansätze untersucht, um die Nukleaseexpression zu begrenzen.
Zunächst haben wir im Rahmen unseres molekularen Harakiri-Projekts gleichzeitig Plasmide in HeLa-Zellen transfiziert, die CjCas9 kodieren, zwei Leitsequenzen (vor und nach GAAr), die auf das Frataxin-Gen abzielen, und zwei Leitsequenzen, die auf das CjCas9-Gen abzielen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass trotz der Selbstzerstörung des CjCas9-Gens in vitro eine effektive Genombearbeitung des FXN-Gens erreicht wurde.
Zweitens fügten wir mit CRISPR-SCReT (Stop Codon Read Through) ein Stopcodon (TGA) am Anfang des CjCas9-Gens ein, um dessen Expression zu unterdrücken. Anschließend induzierten wir die Expression von Cas9 durch Moleküle, die die Translation trotz des vorzeitigen Stopcodons ermöglichen. Dieses Plasmid wurde mit zwei sgRNAs (vor und nach GAAr) in 293T-Zellen transfiziert. Wir stellten eine Deletion des GAAr nur in mit G418 behandelten Zellen fest.
Diese verschiedenen Methoden ermöglichten eine effiziente Bearbeitung des Frataxin-Gens und verhinderten gleichzeitig eine anhaltende Cas9-Expression. Dies könnte die Wahrscheinlichkeit von Off-Target-Mutationen und Immunreaktionen gegen das Cas9-Protein verringern.