Enzymtechnik
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Abstrakt

Design einer α-L-Transfucosidase zur Synthese fucosylierter HMOs

Dora Molnar-Gabor

Es ist bekannt, dass humane Milch-Oligosaccharide (HMOs) gestillten Säuglingen in vielerlei Hinsicht zugute kommen. Daher besteht ein wachsendes Interesse an der Synthese von HMOs, die ihre natürliche Vielfalt nachahmen. Die meisten HMOs sind fucosylierte Oligosaccharide. α-L-Fucosidasen katalysieren die Hydrolyse von α-L-Fucose aus dem nichtreduzierenden Ende eines Glucans. Sie gehören zu den Familien der Glykosidhydrolasen GH29 und GH95. Die Fucosidasen der GH29-Familie weisen einen klassischen Haltemechanismus auf und sind gute Kandidaten für Transfucosidase-Aktivität. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die α-L-Fucosidase aus Thermotoga maritima (TmαFuc) aus der GH29-Familie durch gerichtete Evolution zu einer effizienten Transfucosidase weiterentwickelt werden kann (Osanjo et al. 2007). In dieser Arbeit entwickelten wir semi-rationale Ansätze zur Entwicklung einer α-L-Transfucosidase, ausgehend von der α-L-Fucosidase des Kommensalbakteriums Bifidobacterium longum subsp. infantis (BiAfcB, Blon_2336). Eine effiziente Fucosylierung wurde mit Enzymmutanten (L321P-BiAfcB und F34I/L321P-BiAfcB) erreicht, die eine In-vitro-Synthese von Lactodifucotetraose, Lacto-N-Fucopentaose II, Lacto-N-Fucopentaose III und Lacto-N-Difucohexaose I ermöglichten. Die Enzyme erzeugten auch komplexere HMOs wie fucosylierte Para-Lacto-N-Neohexaose (Fp-LNnH) und mono- oder difucosylierte Lacto-N-Neohexaose (F-LNnH-I, F-LNnH-II und DF-LNnH). Es ist bemerkenswert, dass die Mutation an diesen beiden Positionen nicht zu einer starken Abnahme der Gesamtaktivität des Enzyms führte, was diese Varianten zu interessanten Kandidaten für groß angelegte Transfucosylierungsreaktionen macht. Diese Arbeit bietet zum ersten Mal eine effiziente enzymatische Methode zur Synthese der Mehrheit der fucosylierten HMOs.