Enzymtechnik
Offener Zugang

Abstrakt

Genmutationen enzymatisch entdecken: Chips für eine einfache und hochempfindliche Methode zur Spaltung von Enzym-Fehlpaarungen

Voskarides K

Die Identifizierung unbekannter DNA-Sorten ist in vielen Bereichen der molekularen Wissenschaften eine der wichtigsten Fragen. Die Sanger-Sequenzierung wird zu diesem Zweck in der täglichen Praxis eingesetzt. Wenn Sie jedoch eine große DNA-Menge oder zahlreiche Proben untersuchen müssen, ist diese Methode schwierig, teuer und zeitaufwändig. In letzter Zeit wurde die Sequenzierungstechnologie (NGS) für verschiedene Zwecke des Genom-Screenings eingesetzt. Diese Massensequenzierungstechnologie eignet sich für das Screening einer großen Genomgröße sowie zum Screening einer Liste von Merkmalen, die ähnliche Gene verursachen, wie z. B. den Frühdiabetes des Kindesalters (MODY). Wenn genügend Proben gleichzeitig gesammelt werden, ist NGS eine effiziente und attraktive Methode, da die Bündelung von Proben die laufenden Kosten pro Probe senkt. Wenn Sie jedoch 10 bis 50 kb DNA-Sortierung in einer einzigen Probe untersuchen müssen, benötigen Sie eine effektive und praktische Screeningmethode. Im Allgemeinen waren Einzelstrang-Mutationspolymorphismus (SSCP) und Heteroduplex-Analyse (HA) die am häufigsten verwendeten Techniken aus diesem Grund. Die Empfindlichkeit dieser Techniken war jedoch für eine gründliche Untersuchung nicht ausreichend. Obwohl viele der modifizierten PCR-basierten Transformations-Screening-Techniken entwickelt wurden, wurde keine davon aufgrund der geringen Empfindlichkeit oder möglicherweise Belastung populär. Zwei modifizierte Techniken für HA, die denaturierende Winkelgelelektrophorese (DGGE) und die Temperaturwinkelgelelektrophorese (TGGE), wurden entwickelt, um die Bewegungsverzögerung von Heteroduplex-DNA im Gel durch Veränderung der Geldichte oder -temperatur zu verbessern. Obwohl diese Techniken möglicherweise einen Vorteil gegenüber HA haben, erfordern sie spezielle Ausrüstung zum Ausführen oder Herstellen des Gels. Daher sind diese modifizierten Techniken nicht so populär geworden wie die ursprüngliche HA. Die denaturierende Elite-Flüssigkeitschromatographie (DHPLC) ist eine Art von Mobilitäts-Transfer-Test, der keine Elektrophorese umfasst, sondern Veränderungen anhand der verkürzten Haltbarkeitsdauer des Heteroduplex in einem HPLC-Abschnitt identifiziert. Obwohl diese neue Technologie eine hohe Affektivität erreicht, ist eine langwierige Verbesserung der Bedingungen für die Erkennung von Mutationen für jede DNA-Gruppe erforderlich, um die maximale Affektivität zu erreichen. Eine ideale Methode zum Screening von Mutationen würde nur herkömmliche Geräte und Reagenzien erfordern; ein einziges Protokoll kann auf alle DNA-Gruppen und Mutationstypen angewendet werden und würde eine hohe Affektivität, einen hohen Durchsatz und eine kostengünstige Ausführung erreichen. Die DNA-Fragment-Spaltung (EMC) erfüllt diese Kriterien möglicherweise.