Enzymtechnik
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Abstrakt

Isolierung, Reinigung und Charakterisierung der Sekundärstruktur und kinetische Untersuchung der Lipase aus dem Indischen Großkarpfen, Catla catla (Catla)

Kameshwar Sharma YVR, Neelima Boora und Prasidhi Tyagi

Lipasen sind allgegenwärtige Enzyme, die die Hydrolyse von Fetten in Fettsäuren und Glycerin an der Wasser-Lipid-Grenzfläche katalysieren und die Reaktion in nicht-wässrigen Medien umkehren. Lipasen nehmen aufgrund ihrer neuartigen und vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten in der Oleochemie, organischen Synthese, Reinigungsmittelformulierung und Ernährung einen herausragenden Platz unter den Biokatalysatoren ein. Lipase wurde aus dem Verdauungstrakt und dem Verdauungsdarm von Catla catla (catla) extrahiert und isoliert. Das Gewebe wurde in einem Verhältnis von 1:3 mit Ausgangspuffer (0,01 M TrisHCl, pH 7,2) homogenisiert. Der so erhaltene Rohextrakt wurde mit Ammoniumsulfat (20-80 %) ausgefällt. Überschüssiges Salz wurde durch Dialyse entfernt und das resultierende Dialysat (entsalztes Enzym) wurde einer DEAE-Cellulosesäule zur Ionenaustauschchromatographie bei einer Flussrate von 0,5 ml/min unterzogen. Die Elution wurde durch einen Stufengradienten von NaCl (100-800 mM) im Ausgangspuffer durchgeführt. Aktive Fraktionen wurden als gereinigte Fraktion (PF) zusammengefasst und zur physikalischen Charakterisierung von pH-Wert, Temperatur und Wirkung von Calcium auf die Enzymaktivität, zur strukturellen Charakterisierung, molekularen Charakterisierung und für kinetische Studien verwendet. Die gereinigte Fraktion (PF) zeigte eine endgültige spezifische Aktivität von 1438,72 U/mg. Der optimale pH-Wert lag bei 7,8 und die optimale Temperatur bei 20 °C. Die Schmelztemperatur (Tm) betrug 42 °C und die Aktivierungsenergie der gereinigten Lipase betrug 34,82 KJ/mol/K. Die thermische Stabilität der Lipase lag bei 20 °C. Die Lipaseaktivität blieb bis zu 3 Stunden Inkubation mit 10 mM und 20 mM CaCl2 im Ausgangspuffer erhalten. Dies zeigt, dass Calcium die Denaturierung des Enzyms verstärkt. Die Michaelis-Menten-Konstante (Km) der Lipase aus dem indischen Großkarpfen catla für die Hydrolyse von pNPP betrug 6,695 mM. Die Umsatzzahl (kcat) der Lipase (catla) betrug 0,0022 s-1. Die katalytische Effizienz (kcat/Km) der Lipase betrug 0,0003412 s-1 mM-1. Die SDS-PAGE der gereinigten Lipase (PF) ergab ein homogenes Einzelband mit einer Molekülmasse von 70 kDa. Die sekundäre Strukturanordnung der α-Helices und β-Stränge der gereinigten Lipase ergab bei Verwendung des Zirkulardichroismus 48,51 % bzw. 9,74 %.