Zeitschrift für medizinische Diagnosemethoden
Offener Zugang
ISSN: 2168-9784
ISSN: 2168-9784
Satoru Kaneko*, Kiyoshi Takamatsu
Ziele: Durchführung vergleichender Studien zur erneuten Validierung der Prinzipien und der quantitativen Leistung des Sperm Chromatin Dispersion Test (SCD) und des Comet Assay (CA).
Methoden: Menschliche Spermien ohne und mit Granulatfragmenten im Endstadium der Fragmentierung wurden aus normozoospermischem Sperma isoliert und als natürlich vorkommende negative und positive Kontrollen (NC bzw. PC) verwendet. Sowohl SCD als auch CA extrahierten Nukleoproteine mit 2,0 mol/l NaCl, 1,0 mmol/l DTT. SCD stellte fest, dass der DNA-Schaden umgekehrt proportional zur Fläche des violetten Halos war. Die CA schätzte den Grad des DNA-Schadens elektrophoretisch anhand der Anzahl der Granulatfragmente; der sogenannte Kometenschweif, ihre elektrophoretischen Merkmale wurden mit der Single-Cell Pulsed-Field Gel Electrophoresis (SCPFGE) verglichen.
Ergebnisse: Der violette Hof in SCD bestand aus mit Kristallviolett (CV) färbbaren Nukleoproteinen, die an den bestrahlten DNA-Fasern hafteten. SCD konnte nicht zwischen NC und PC unterscheiden. Die restlichen Nukleoproteine blockierten die Migration von DNA in der natürlichen CA; im Gegensatz dazu entlud SCPFGE mit tryptischer Verdauung im Gel die faserigen und körnigen Fragmente jenseits der verlängerten DNA-Fasern. Die alkalische CA wurde mit DNA in 0,3 mol/l NaOH durchgeführt. Obwohl die DNA in körnige Fragmente zerkleinert wurde, behielten die restlichen Nukleoproteine ihre Bindungsfähigkeit an DNA und fixierten dennoch die neu erzeugten Fragmente.
Schlussfolgerung: DNA-Fragmentierungsanalysen erfordern die Messung eines frühen Fragmentierungsstadiums in getrennten beweglichen Spermien. Ein Mangel an Proteolyse mindert die quantitative Leistung von neutraler und alkalischer CA. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass SCD und CA als Werkzeuge zur Datenerfassung für klinische Statistiken nicht sensibel genug sind.