Zeitschrift für medizinische Diagnosemethoden
Offener Zugang

Abstrakt

Spermienspezifische zweistufige Farbstoffausschlusstests zur Bewertung der Integrität von Plasma- und Organellenmembranen – neuer Ansatz zur Qualitätssicherung von Spermien bei intrazytoplasmatischer Spermieninjektion

Satoru Kaneko, Yuki Okada, Kiyoshi Takamatsu

Ziel: Die umfassende Bewertung der Plasma- und Organellenmembranen ist ein neuer Ansatz zum Verständnis der Fruchtbarkeit menschlicher Spermien. Die vorliegende Studie entwickelte zwei Arten spermienspezifischer 2-Stufen-Farbstoffausschlusstests zur Bewertung der Plasma- und Organellenmembranen in menschlichem Sperma.

Methoden: Spermienspezifischer 2-Stufen-Farbstoffausschlusstest: Spermien wurden mit Reaktivrot 195 (RR195) oder Cy3-konjugiertem Concanavalin A (Cy3-con A) in isotonischem Kulturmedium inkubiert und nach Ausschluss der Plasmamembran mit Methanol mit Reaktivblau 222 bzw. Alexa 488-konjugiertem Concanavalin A gegengefärbt. Die Integrität der Organellenmembran in den Mitochondrien wurde durch Retention von Mito Tracker FM beobachtet. Das cellROX Orange erzeugte bei Oxidation durch reagierte reaktive Sauerstoffspezies eine orange Fluoreszenz.

Ergebnisse: Der spermienspezifische zweistufige Farbstoffausschlusstest besteht aus der Permeation und Bindung des ersten Farbstoffs an die Kerne durch beschädigte Plasma- und Organellenmembranen. Nach dem Membranausschluss wurden neu freigelegte Kerne oder die innere Akrosommembran mit dem zweiten Farbstoff gegengefärbt. Die intakten Plasma- und Akrosommembranen in menschlichen beweglichen Spermien (lebende Spermien; LS) schlossen RR195 und Cy3-con A aus, aber die denaturierten ließen die Permeation zu. LS färbten sich blau oder erzeugten eine grüne Fluoreszenz, die denaturierten wiederum eine rote bzw. rote Fluoreszenz. Die Fluoreszenz von Mito Tracker FM und cellROX Orange in den Mitochondrien bestätigte die Normalität der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien mit intakter Organellenmembran. Der abgeleitete einstufige RR195-Ausschlusstest ist ein brauchbarer Kandidat für die intraoperative zerstörungsfreie Bewertung der beweglichen Spermien bei klinischer ICSI.

Schlussfolgerung: Die Farbstoffausschluss- und Farbstoffretentionstests tragen zur präoperativen Beurteilung der Spermienqualität bei und der modifizierte einstufige Farbstoffausschlusstest kann für die intraoperative Spermienauswahl bei der klinischen intrazytoplasmatischen Spermieninjektion nützlich sein.