HIRA Kumari Shah
Die zytotoxische Wirkung von Eugenol auf die Expression molekularer Marker, die mit der osteogenen Differenzierung von menschlichen Zahnmarkzellen in Zusammenhang stehen, wie die Kollagensynthese und die Expression zweier mit der Osteogenese in Zusammenhang stehender Gene, alkalische Phosphatase (ALP) und Knochensialoprotein (BSP), wurde an menschlichen Zahnmarkzellen (D824-Zellen) untersucht. Zellwachstum und Überleben wurden durch die konzentrationsabhängige Behandlung der Zellen mit Eugenol verringert. Die Einbaurate von [3H]-Prolin in die säureunlösliche Fraktion und die Synthese von Kollagenen des Typs I–V wurden durch die konzentrationsabhängige Behandlung der Zellen mit Eugenol ebenfalls verringert. Die mRNA-Expression von ALP wurde in Eugenol ausgesetzten Zellen kaum beeinflusst, während die mRNA- und Proteinexpression von BSP je nach Eugenolkonzentration herunterreguliert wurde. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass Eugenol bei endodontischen Behandlungen eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Hartgewebe spielen, und dass es daher zytotoxische Wirkungen auf die normale Funktion von Stammzellen haben kann, die im menschlichen Zahnmark und im Desmodont vorkommen. Eugenol (4-Allyl-2-methoxyphenol) ist der Hauptbestandteil von Nelkenöl (Eugenia caryophyllate). Es wird in der Zahnheilkunde als Duft- und Geschmacksstoff, Insektenlockstoff sowie als lokales Antiseptikum und entzündungshemmendes Analgetikum verwendet. Mit Zinkoxid zu einer dicken Paste vermischt wird Eugenol in der Zahnheilkunde auch als Bestandteil von Parodontalverbänden, Abformmaterialien und endodontischen Medikamenten verwendet. Einige der endodontischen Medikamente, die den Zähnen verabreicht werden, können das Pulpagewebe oder das Parodont erreichen, nachdem sie den Zahnschmelz und das Dentin durchdrungen bzw. die apikalen Foramen passiert haben [1]. Wären die endodontischen Medikamente zytotoxisch, könnten sie die normale Funktion der im menschlichen Zahnmarkgewebe [2] und im Parodontalband [3] vorhandenen Stammzellen stören. Deshalb ist es wichtig, die Zytotoxizität von chemischen Wirkstoffen für endodontische Behandlungen zu untersuchen. Trotz der umfassenden klinischen Verwendung in der Zahnheilkunde ist Eugenol für verschiedene Arten menschlicher Zellen zytotoxisch, darunter Zahnmarkzellen [4], Gingivafibroblasten [5] und Parodontalbandfibroblasten [6]. Die in fast allen Studien gezeigte Zytotoxizität von Eugenol wurde durch das Wachstum oder die Lebensfähigkeit der mit Eugenol behandelten Zellen bestimmt. Es wurden nur wenige Studien durchgeführt, um die zytotoxische Wirkung von Eugenol auf die differenzierungsbezogenen Phänotypen in menschlichen Zahnmarkzellen zu bestimmen. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die zytotoxische Wirkung von Eugenol auf die Expression von molekularen Markern, die mit der osteogenen Differenzierung menschlicher Zahnmarkzellen in Zusammenhang stehen, wie Kollagensynthese und die Expression von zwei Osteogenese-bezogenen Genen,alkalische Phosphatase (ALP) und Knochensialoprotein (BSP) in menschlichen Zahnmarkzellen. Goldberg et al. [7] haben gezeigt, dass die mit der Osteogenese in Zusammenhang stehenden Proteine, darunter Kollagen, ALP und BSP, während der physiologischen und reparativen Dentinogenese synthetisiert werden. Kollagen, insbesondere Typ I, macht 90 % der Dentinmatrix aus. Die Kollagenmatrix bietet nicht nur das Gerüst zur Förderung und Entwicklung mineralisierten Gewebes, sondern auch eine hervorragende natürliche Stütze für nicht-kollagene Proteine wie BSP und Dentinsialoprotein [7]. ALP ist ein wesentlicher Faktor bei der Dentinmineralisierung und der Bildung von azellulärem Zement [8]. BSP ist eines der nicht-kollagenen Proteine, die in Knochen, Dentin und Zahnmark vorkommen [9] und als früher Marker für die Differenzierung von Osteoblasten [10] und odontoblastenähnlichen Zellen [11] gilt. Es bindet an spezifische Reste von Kollagen Typ I [12] und dient als wirksamer Nukleator für die Bildung von Hydroxylapatit auf den Kollagenfibrillen [11]. Menschliche Zahnmarkzellen (D824-Zellen), die aus dem Zahnmarkgewebe eines unteren Weisheitszahns einer 22-jährigen Frau gewonnen wurden, wurden wie zuvor beschrieben gezüchtet [13]. D824-Zellen können in vitro mineralisierte Knötchen bilden und in immungeschwächten Mäusen odontoblastenähnliche Zellen und dentinähnliches Gewebe rekrutieren [13]. Alle Experimente wurden mit D824-Zellen in 10–15 Passagen durchgeführt. Eugenol (> 95 % rein) wurde von Tokyo Kasei Kogyo (Tokio, Japan) bezogen und in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, Tokio, Japan) in einer Konzentration von 200 mM gelöst. Die Lösung wurde mit Kulturmedium auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und auf D824-Zellen aufgebracht. Das Zellüberleben wurde anhand der Koloniebildungseffizienz der mit Eugenol behandelten Zellen bestimmt. Zellen (500) wurden in dreifacher Ausfertigung auf 60-mm-Schalen plattiert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Eugenol in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Kontrollkulturen wurden mit DMSO-Medium inkubiert. Nach zwei Waschungen mit 2 ml frischem Medium wurden die Zellen 13 Tage lang zur Koloniebildung inkubiert. Die Zellen wurden mit absolutem Methanol fixiert und mit einer 10%igen Giemsa-Lösung gefärbt. Thompson et al. [19]. haben gezeigt, dass Eugenol in isolierten Rattenhepatozyten zu dem reaktiven Zwischenprodukt, möglicherweise einem Chinonmethid, metabolisiert wird und dass die zytotoxischen Wirkungen von Eugenol in Hepatozyten vom Stoffwechsel abhängen. Eugenol löst in Embryonenzellen des Syrischen Hamsters (SHE) in Gegenwart einer Mischung aus postmitochondrialem Rattenleberüberstand (PMS) eine außerplanmäßige DNA-Synthese aus [20]. Es induziert auch Chromosomenaberrationen in SHE-Zellen, und die Häufigkeit von ChromosomenaberrationenDie Kollagenmatrix liefert nicht nur das Gerüst zur Förderung und Entwicklung mineralisierten Gewebes, sondern auch eine ausgezeichnete natürliche Stütze für nicht-kollagene Proteine wie BSP und Dentin-Sialoprotein [7]. ALP ist ein wesentlicher Faktor bei der Dentinmineralisierung und der Bildung von azellulärem Zement [8]. BSP ist eines der nicht-kollagenen Proteine, die in Knochen, Dentin und Zahnmark vorkommen [9] und als früher Marker für die Differenzierung von Osteoblasten [10] und Odontoblasten-ähnlichen Zellen [11] gilt. Es bindet an die spezifischen Reste von Kollagen Typ I [12] und dient als wirksamer Nukleator für die Bildung von Hydroxylapatit auf den Kollagenfibrillen [11]. Menschliche Zahnmarkzellen (D824-Zellen) aus dem Zahnmarkgewebe eines unteren Weisheitszahns einer Frau (22 Jahre alt) wurden wie zuvor beschrieben gezüchtet [13]. D824-Zellen besitzen die Fähigkeit, in vitro mineralisierte Knötchen zu bilden und in immungeschwächten Mäusen odontoblastenähnliche Zellen und dentinähnliches Gewebe zu rekrutieren [13]. Alle Experimente wurden mit D824-Zellen in 10–15 Passagen durchgeführt. Eugenol (> 95 % rein) wurde von Tokyo Kasei Kogyo (Tokio, Japan) bezogen und in 200 mM Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, Tokio, Japan) gelöst. Die Lösung wurde mit Kulturmedium auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und auf D824-Zellen aufgebracht. Das Zellüberleben wurde anhand der Koloniebildungseffizienz der mit Eugenol behandelten Zellen bestimmt. Zellen (500) wurden in dreifacher Ausführung auf 60-mm-Schalen plattiert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden 24 h lang mit Eugenol in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Kontrollkulturen wurden mit DMSO-Medium inkubiert. Nach zwei Waschungen mit 2 ml frischem Medium wurden die Zellen 13 Tage lang zur Koloniebildung inkubiert. Die Zellen wurden mit absolutem Methanol fixiert und mit einer 10%igen Giemsa-Lösung gefärbt. Thompson et al. [19]. haben gezeigt, dass Eugenol in isolierten Rattenhepatozyten zu dem reaktiven Zwischenprodukt, möglicherweise einem Chinonmethid, metabolisiert wird und dass die zytotoxischen Wirkungen von Eugenol in Hepatozyten vom Metabolismus abhängen. Eugenol löst in Gegenwart einer Mischung aus postmitochondrialem Rattenleberüberstand (PMS) eine ungeplante DNA-Synthese in syrischen Hamsterembryozellen (SHE) aus [20]. Es induziert auch Chromosomenanomalien in SHE-Zellen und die Häufigkeit von ChromosomenanomalienDie Kollagenmatrix liefert nicht nur das Gerüst zur Förderung und Entwicklung mineralisierten Gewebes, sondern auch eine ausgezeichnete natürliche Stütze für nicht-kollagene Proteine wie BSP und Dentin-Sialoprotein [7]. ALP ist ein wesentlicher Faktor bei der Dentinmineralisierung und der Bildung von azellulärem Zement [8]. BSP ist eines der nicht-kollagenen Proteine, die in Knochen, Dentin und Zahnmark vorkommen [9] und als früher Marker für die Differenzierung von Osteoblasten [10] und Odontoblasten-ähnlichen Zellen [11] gilt. Es bindet an die spezifischen Reste von Kollagen Typ I [12] und dient als wirksamer Nukleator für die Bildung von Hydroxylapatit auf den Kollagenfibrillen [11]. Menschliche Zahnmarkzellen (D824-Zellen) aus dem Zahnmarkgewebe eines unteren Weisheitszahns einer Frau (22 Jahre alt) wurden wie zuvor beschrieben gezüchtet [13]. D824-Zellen besitzen die Fähigkeit, in vitro mineralisierte Knötchen zu bilden und in immungeschwächten Mäusen odontoblastenähnliche Zellen und dentinähnliches Gewebe zu rekrutieren [13]. Alle Experimente wurden mit D824-Zellen in 10–15 Passagen durchgeführt. Eugenol (> 95 % rein) wurde von Tokyo Kasei Kogyo (Tokio, Japan) bezogen und in 200 mM Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, Tokio, Japan) gelöst. Die Lösung wurde mit Kulturmedium auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und auf D824-Zellen aufgebracht. Das Zellüberleben wurde anhand der Koloniebildungseffizienz der mit Eugenol behandelten Zellen bestimmt. Zellen (500) wurden in dreifacher Ausführung auf 60-mm-Schalen plattiert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden 24 h lang mit Eugenol in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Kontrollkulturen wurden mit DMSO-Medium inkubiert. Nach zwei Waschungen mit 2 ml frischem Medium wurden die Zellen 13 Tage lang zur Koloniebildung inkubiert. Die Zellen wurden mit absolutem Methanol fixiert und mit einer 10%igen Giemsa-Lösung gefärbt. Thompson et al. [19]. haben gezeigt, dass Eugenol in isolierten Rattenhepatozyten zu dem reaktiven Zwischenprodukt, möglicherweise einem Chinonmethid, metabolisiert wird und dass die zytotoxischen Wirkungen von Eugenol in Hepatozyten vom Metabolismus abhängen. Eugenol löst in Gegenwart einer Mischung aus postmitochondrialem Rattenleberüberstand (PMS) eine ungeplante DNA-Synthese in syrischen Hamsterembryozellen (SHE) aus [20]. Es induziert auch Chromosomenanomalien in SHE-Zellen und die Häufigkeit von ChromosomenanomalienMenschliche Zahnmarkzellen (D824-Zellen), die aus dem Zahnmarkgewebe eines unteren Weisheitszahns einer Frau (22 Jahre alt) gewonnen wurden, wurden wie zuvor beschrieben gezüchtet [13]. D824-Zellen haben die Fähigkeit, in vitro mineralisierte Knötchen zu bilden und odontoblastenähnliche Zellen und dentinähnliches Gewebe in immungeschwächten Mäusen zu rekrutieren [13]. Alle Experimente wurden mit D824-Zellen in 10–15 Passagen durchgeführt. Eugenol (> 95 % rein) wurde von Tokyo Kasei Kogyo (Tokio, Japan) bezogen und bei 200 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, Tokio, Japan) gelöst. Die Lösung wurde mit Kulturmedium auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und auf D824-Zellen aufgetragen. Das Zellüberleben wurde anhand der Koloniebildungseffizienz der mit Eugenol behandelten Zellen bestimmt. Zellen (500) wurden in dreifacher Ausführung auf 60-mm-Schalen plattiert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Eugenol in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Kontrollkulturen wurden mit DMSO-Medium inkubiert. Nach zwei Waschungen mit 2 ml frischem Medium wurden die Zellen 13 Tage lang zur Koloniebildung inkubiert. Die Zellen wurden mit absolutem Methanol fixiert und mit einer 10%igen Giemsa-Lösung gefärbt. Thompson et al. [19]. haben gezeigt, dass Eugenol in isolierten Rattenhepatozyten zu dem reaktiven Zwischenprodukt, möglicherweise einem Chinonmethid, metabolisiert wird und dass die zytotoxischen Wirkungen von Eugenol in Hepatozyten vom Stoffwechsel abhängen. Eugenol löst in Gegenwart einer Mischung aus postmitochondrialem Rattenleberüberstand (PMS) eine ungeplante DNA-Synthese in Embryozellen des syrischen Hamsters (SHE) aus [20]. Es induziert auch Chromosomenabweichungen in SHE-Zellen und die Häufigkeit von ChromosomenabweichungenMenschliche Zahnmarkzellen (D824-Zellen), die aus dem Zahnmarkgewebe eines unteren Weisheitszahns einer Frau (22 Jahre alt) gewonnen wurden, wurden wie zuvor beschrieben gezüchtet [13]. D824-Zellen haben die Fähigkeit, in vitro mineralisierte Knötchen zu bilden und odontoblastenähnliche Zellen und dentinähnliches Gewebe in immungeschwächten Mäusen zu rekrutieren [13]. Alle Experimente wurden mit D824-Zellen in 10–15 Passagen durchgeführt. Eugenol (> 95 % rein) wurde von Tokyo Kasei Kogyo (Tokio, Japan) bezogen und bei 200 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, Tokio, Japan) gelöst. Die Lösung wurde mit Kulturmedium auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt und auf D824-Zellen aufgetragen. Das Zellüberleben wurde anhand der Koloniebildungseffizienz der mit Eugenol behandelten Zellen bestimmt. Zellen (500) wurden in dreifacher Ausführung auf 60-mm-Schalen plattiert und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Eugenol in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Kontrollkulturen wurden mit DMSO-Medium inkubiert. Nach zwei Waschungen mit 2 ml frischem Medium wurden die Zellen 13 Tage lang zur Koloniebildung inkubiert. Die Zellen wurden mit absolutem Methanol fixiert und mit einer 10%igen Giemsa-Lösung gefärbt. Thompson et al. [19]. haben gezeigt, dass Eugenol in isolierten Rattenhepatozyten zu dem reaktiven Zwischenprodukt, möglicherweise einem Chinonmethid, metabolisiert wird und dass die zytotoxischen Wirkungen von Eugenol in Hepatozyten vom Stoffwechsel abhängen. Eugenol löst in Gegenwart einer Mischung aus postmitochondrialem Rattenleberüberstand (PMS) eine ungeplante DNA-Synthese in Embryozellen des syrischen Hamsters (SHE) aus [20]. Es induziert auch Chromosomenabweichungen in SHE-Zellen und die Häufigkeit von ChromosomenabweichungenEugenol löst in Embryonenzellen des Syrischen Hamsters (SHE) in Gegenwart einer Mischung aus postmitochondrialem Rattenleberüberstand (PMS) eine außerplanmäßige DNA-Synthese aus [20]. Es induziert auch Chromosomenaberrationen in SHE-Zellen, und die Häufigkeit von ChromosomenaberrationenEugenol löst in Embryonenzellen des Syrischen Hamsters (SHE) in Gegenwart einer Mischung aus postmitochondrialem Rattenleberüberstand (PMS) eine außerplanmäßige DNA-Synthese aus [20]. Es induziert auch Chromosomenaberrationen in SHE-Zellen, und die Häufigkeit von Chromosomenaberrationen