Transkriptomik: Offener Zugang
Offener Zugang

Abstrakt

Puromycin-Selektion bringt RNA-Sequenzprofile primärer menschlicher Erythroblasten durcheinander

Guo RL, Lee YT, Byrnes C und Miller JL*

Die lentivirale Transduktion mit anschließender Puromycin-Selektion ist ein anerkanntes Verfahren für Gentransfer- und Expressionsexperimente mit verschiedenen Zelltypen, darunter auch menschliche hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen. Trotz seiner weit verbreiteten Anwendung ist die Forschung zu den möglichen Auswirkungen der bakteriellen Genexpression der Puromycin-N-Acetyltransferase (pac) in Säugetierzellkulturen unvollständig. Hier wurde das Potenzial der Puromycin-Selektion, Transkriptomprofile zu beeinflussen, anhand eines gut untersuchten Modells für menschliche Erythropoese untersucht. Die Experimente wurden mit primären CD34(+)-Zellen von sechs gesunden erwachsenen menschlichen Spendern durchgeführt, die mit zwei handelsüblichen pac-kodierenden lentiviralen Vektoren transduziert und mit nicht-transduzierten Kontrollzellen verglichen wurden. RNA-Seq-Genexpressionsprofile wurden im Proerythroblastenstadium der Differenzierung erstellt, dann wurde die differenzielle Genexpression mit DEseq2 in der R-Studio-Software analysiert. Unterschiede zwischen Spendern in den Genexpressionsprofilen und Unterschiede zwischen Puromycin-selektierten Populationen nach der Transduktion der einzelnen lentiviralen Vektoren zeigten sich in signifikanten Unterschieden in den RNA-Nachweisniveaus von weniger als 0,1 %. Die Puromycin-Selektion nach der Pac-Gen-Transduktion verursachte jedoch signifikante Veränderungen in über 5 % der mRNA im Vergleich zu nicht-transduzierten Kontrollen. Die Ergebnisse legen nahe, dass das Potenzial der Puromycin-Selektion, die Interpretation von RNA-Seq-Transkriptomprofilen zu verfälschen, berücksichtigt werden sollte.